ICS 65.020.01 B 15 DB21 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21/T 3074—2018 风沙半干旱区玉米/花生防蚀增效 花生抗网斑病鉴定技术规程 Rule for evaluation of resistance to web blotch in peanut 2018 - 12 - 25 发布 辽宁省市场监督管理局 2019 - 01 - 25 实施 发 布 DB21/T 3074—2018 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由辽宁省农村经济委员会提出并归口。 本标准由辽宁省农业科学院负责起草。 本标准主要起草人：臧超群、林英、谢瑾卉、于舒怡、梁春浩、刘晓舟、安福涛、张海东、金桂华。 1 DB21/T 3074—2018 花生抗网斑病鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了花生抗网斑病（Phoma arachidicola Marasas Pauer & Boerema）鉴定技术的病原物分 离、接种体制备、室内抗性鉴定、田间抗性鉴定、病情调查、抗性评价、鉴定记载方法等。 本标准适用于花生（Arachis hypogaea L.）品种及种质资源对花生网斑病抗性的室内、田间鉴定及 评价。 2 规范性引用文件 下列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 2391 农作物品种区域试验与鉴定规程 花生 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 试剂、材料与仪器设备 本标准所用试剂在未加说明时均采用分析纯试剂。实验室用水应符合GB/T 6682中规定的三级水要 求。 3.1 PDA 培养基 称取 200g 马铃薯，洗净去皮切碎，加入 1000mL 水，煮沸 20 min—30min，纱布过滤，补水至 1000mL， 再加入 18g 琼脂和 18g 葡萄糖，搅拌均匀，高压灭菌（121℃，20min） 。 3.2 OA 培养基 称取燕麦粉 15g，加入水 1000mL，煮沸 30min，加入琼脂 10g，pH 自然，高压灭菌（121℃，20min） 。 3.3 恒温培养箱：（28+2）℃。 3.4 显微镜：物镜头 10 倍-100 倍。 3.5 电子天平：感量 0.01g。 3.6 超净工作台。 2 DB21/T 3074—2018 3.7 高压灭菌器。 3.8 冷藏箱（-4℃）。 3.9 低温冰箱：最低温度-40℃ 4 病原物分离与接种体制备 4.1 病原物分离 从具有典型症状的花生叶片病斑处挑取花生网斑病菌分生孢子器置于无菌水中震荡3min，将分生孢 子悬浮液涂布于水琼脂平板上，用接种针挑取单孢置于马铃薯葡萄糖（PDA）培养基上，26℃培养箱中 暗培养，经观察菌落和孢子形态结合ITS序列比对，鉴定为花生茎点霉菌(P. arachidicola Marasas. Pauer & Boerema)，致病性测定后确定为供接种用菌株。于4℃条件下保存，或20%甘油中-40℃条件下 长期保存，备用。 4.2 接种体制备 接种前 15d~30d，将病菌接种于马铃薯葡萄糖（PDA）培养基平板上 25℃恒温培养 5d，利用 5mm 打 孔器从菌落边缘制取菌饼，置于燕麦琼脂（OA）培养基平板上 25℃、近紫外灯照射（波长 340~380nm， 8W×3）培养 10d~20d。用无菌解剖刀于超净工作台中刮取病菌的分生孢子器，置于装有少量无菌水的 5 50mL 无菌烧杯中，静置 20min，使分生孢子器吸水胀破，释放分生孢子，配制成浓度为 1×10 个/mL 孢 子悬浮液（如未立即接种使用，可置 4℃条件下保存，保存时间 3d 以内）。接种前每毫升孢子悬浮液中 加入 Tween201μL 以增加病菌孢子与叶片的粘附性，加入 0.05mg 蔗糖提高孢子萌发率。 5 室内抗性鉴定 5.1 室内离体叶片准备 在长宽高为10cm×10cm×8cm的花盆中播种籽粒饱满的花生种子3粒，定期浇水，于每天26℃、12h 光暗交替的培养箱中培养至下针期。剪取底部向上的第3、4片复叶，用脱脂棉包裹叶柄插入经人工打孔 后的接种杯（直径4cm，高4.8cm）中，杯内放入30mL清水。 5.2 接种 用8号水粉笔沾取孢子悬浮液均匀涂抹于离体叶片，直至整片复叶涂满孢子悬浮液，用6号自封袋 （120mm×170mm）保湿。 5.3 接种后管理 3 DB21/T 3074—2018 将接种后的离体叶片放置于每天26℃、12h光暗交替的植物培养箱中培养。 5.4 病情调查 接种后25d~30d，进行病情调查，同批次的材料应在24h内完成。 5.5 调查方法 目测每份鉴定材料发病状况，根据病害症状描述，调查记载病情级别。 5.6 病情分级 病情分级及其对应的症状描述见表 1。 表 1 花生品种抗网斑病鉴定病情级别划分标准 病情级别 病害症状描述 0 整片复叶无病症状； 1 病斑面积＜10%； 3 10%≤病斑面积＜25%； 5 25%≤病斑面积＜50%； 7 50≤病斑面积＜75%； 9 75%≤病斑面积。 6 田间抗性鉴定 6.1 抗性鉴定圃设置 抗性鉴定圃设置在具备良好的自然发病环境条件、灌溉良好、地势平坦、地力均匀的地块。 6.2 小区设计 鉴定材料随机排列。小区行长5m，4行区，行距0.5m或0.6m，小区保苗80穴左右。每20份鉴定材料 各设1组抗、感病对照，抗病对照品种为鲁花11，感病对照品种为四粒红。 6.3 种植要求 鉴定材料播种时间、栽培管理与大田生产相同，整个生长季不施用杀菌剂。 6.4 接种 6.4.1 接种期 接种期为花针期。 6.4.2 接种方法 4 DB21/T 3074—2018 每个品种随机连续选择 10 株，用 8 号水粉笔沾取孢子悬浮液均匀涂布主茎中下部 4 片复叶，用 6 号自封袋（120mm×170mm）保湿。 6.5 接种后管理 在接种期如遇干旱天气，应及时进行田间浇灌，确保病害发生。 6.6 病情调查 接种后 15d~20d，进行病情调查，同批次的材料应在 1d~2d 内完成。 6.7 调查方法 同 5.5 6.8 病情分级 同 5.6 7 抗性评价 7.1 鉴定有效性判别 当感病对照材料达到其相应感病程度（9 级） ，该批次材料抗网斑病鉴定视为有效。 7.2 抗性评价标准 依据鉴定材料发病程度（病情级别）确定其抗性水平，划分标准见表 2。 表 2 花生抗网斑病评价标准 病情级别 抗性评价 0 免疫（IM） 1 高抗（HR） 3 抗 （R） 5 中抗（MR） 7 感 9 高感（HS） （S） 7.3 重复鉴定 初次鉴定时表现为免疫、高抗和抗病的花生品种应在次年进行重复鉴定。 7.4 抗性评价 5 DB21/T 3074—2018 对初次鉴定结果和重复鉴定结果进行比较，以记载的最高病情级别为最终鉴定结果，并依此结果对 鉴定材料进行抗性评价 8 鉴定记载表格 花生抗网斑病鉴定结果记载见表 3。 表3 编 号 年花生抗网斑病鉴定结果记载表 品种名称 病情级别 抗性评价 注 1: 鉴定地点 注 2: 接种病原菌分离物编号 注 3: 接种日期 调查日期 鉴定技术负责人（签字）： 6 DB21/T 3074—2018 附录 A （资料性附录） 花生网斑病菌 A.1 学名和形态描述 A.1.1 学名 花生网斑病致病菌为花生茎点霉(Phoma arachidicola Marasas Pauer & Boerema)，半知菌门 （Deuteromycotina），腔孢纲(CoeZomycetes），球壳孢目（Sphacropsidales），茎点霉属（Phoma）。 A.1.2 形态描述 花生网斑病菌丝体在燕麦琼脂培养基（OA）上菌落呈白色至灰白色，圆形，粘性较差，菌丝体白色 透明，有隔，分生孢子器褐色，圆形或不规则形，有孔口，其大小为 175.5μm×96.85μm。分生孢子椭 圆形，无色单孢，通常中间有隔膜，顶端有油球，其大小为 5.89μm×3.41μm。厚垣孢子单生或串生， 外壁和两孢子夹壁变厚，暗褐色，类球形或不规则形，单孢被1个或几个横隔分开，分隔处缢缩 9-12μm ×8-17μm。 A.1.3 病菌图片 茎点霉分生孢子器及分生孢子 花生网斑病菌菌落形态 7 DB21/T 3074—2018 附录 B (资料性附录) 花生网斑病症状 B.1 病名和症状描述 B.1.1 病名 花生网斑病 peanut web blotch B.1.2 症状描述 花生网斑病是花生生产上一种常见的真菌病害,主要为害叶片，也可为害茎和叶柄，其症状随发病 条件的不同有所差异。病斑先出现在植株基部的叶片上，侵染初期菌丝体以菌索状于叶片表面蜡质层下， 呈白网状，随后从侵染点沿叶脉以放射方式向外扩展，呈星芒状粉点，随病斑扩大，由白、灰白、褐至 黑褐色，形成边缘不清网状斑。当湿度大、温度高时，便出现直径 1~1.5cm 的大块斑点。病斑部背部初 期和中期不表现症状，后期出现褐色斑痕，表皮下有黑色小突起。生产上该病常与褐斑病、黑斑病混合 发生，造成严重落叶。 B.1.3 症状图片 花生网斑病田间症状 _________________________________ 8