ICS 65.150 B 51 DB21 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21/T 3120—2019 水产动物物种分子鉴定 COI、16S rRNA 分子标记法 Technical specification for species molecular identification using COI and 16S rRNA of aquatic animals 2019 - 02 - 28 发布 辽宁省市场监督管理局 2019 - 03 - 28 实施 发 布 DB21/T 3120—2019 前 言 本标准依据GB/T 1.1—2009给出的规则制定。 本标准由大连市质量技术监督局提出。 本标准由辽宁省农业农村厅归口。 本标准主要起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院。 本标准主要起草人：高磊、赫崇波、鲍相渤、高祥刚。 附录A、B、C为资料性附录。 I DB21/T 3120—2019 水产动物物种分子鉴定 COI、16S rRNA 分子标记法 1 范围 本方法规定了水产动物物种分子鉴定 COI、16S rRNA分子标记法的相关术语和定义，标记方式， 试剂、仪器和设备，样品采集、保存和前处理，DNA提取和检测，序列扩增和测序，以及物种鉴定的 方法。 本方法适用于水产动物物种分子鉴定 COI、16S rRNA分子标记法。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 水产动物物种分子鉴定 aquatic species molecular identification 指利用分子生物学手段,对水产动物样本（尤其适用于形态学特征相近、模糊或丢失的样本）的分 子标记进行分析，鉴定生物种类的过程。 3.2 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction（PCR） 用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA 聚合酶催化下，在体外人工合成特异DNA片段的过程。 3.3 DNA序列测定 DNA sequencing 测定DNA分子的核苷酸序列。 3.4 序列比对 alignment 为确定两个或多个序列之间的相似性和同源性，将他们按照一定的规律进行排列。 3.5 1 DB21/T 3120—2019 DNA条形码-COI 细胞色素c氧化酶亚基I（cytochrome c coxidase subunit I）。 3.6 16S rRNA 16S核糖体核糖核酸（16S ribosomal RNA）。 4 标记方式 水产动物的COI和16S rRNA的DNA序列进化速度较快，同时又相对保守，可作为分子标记条形码用于 物种鉴定。通过PCR技术扩增水产动物的COI和16S rRNA基因部分序列，测序后在已知数据库中进行序列 比对，确定物种分类信息。本方法同时对COI和16S rRNA两种分子标记条形码进行分析，并在GenBank （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）和BOLD System（http://www.boldsystems.org）两个数 据库中比对，确保鉴定成功率和准确率。 5 试剂、仪器和设备 5.1 试剂 实验仅使用分析纯试剂，水应符合GB/T 6682一级水要求。主要包含以下内容： ——无水乙醇； ——95 %乙醇； ——TE 缓冲液（pH 7.6）（100 mol/L Tris-Cl，pH 7.6；10 mmol/L EDTA，pH 8.0）； ——Taq 酶（5 U/μL）； ——超纯水； ——10×PCR 缓冲液（500 mmol/L KCl；100 mmol/L Tris-Cl，pH 8.3；15 mmol/L MgCl2）； ——引物（10 μmol/L）； ——dNTP 混合液（每种脱氧核糖核苷三磷酸浓度 2.5 mmol/L）； ——溴化乙锭（10 mg/mL）； ——琼脂糖； ——电泳标记物（markers）； ——平衡酚； ——氯仿/异戊醇（24:1）； ——10×Tris 硼酸（10×TBE）电泳缓冲液； ——灭菌蒸馏水； ——液氮； ——细胞裂解液（20 mmol/L）。 5.2 仪器和设备 实验用仪器和设备主要包含以下内容： ——凝胶成像分析系统； ——PCR 仪； ——低温高速离心机（4 ℃，12000 转）； 2 DB21/T 3120—2019 ——稳压稳流电泳仪； ——单道可调移液器； ——电子天平（0.001 g）； ——水浴恒温震荡器； ——电泳槽； ——紫外分光光度计； ——遗传分析仪。 6 样品采集、保存和前处理 6.1 样品采集、保存 样本采集和后续实验应在生物安全实验室进行。选择DNA含量高、多糖等含量低的肌肉、肠道、 体腔液、鱼鳍等组织进行采样，样品可通过-20℃冷冻、或4℃冰鲜等方式暂时保存。 6.2 样品前处理 将样品切成5 mm左右直径的小块或薄片，用灭菌蒸馏水洗净，按1:10左右比例将样品放入盛有95 % 乙醇的离心管中，4 ℃保存。 7 DNA 提取和检测 7.1 DNA 提取 7.1.1 取 0.1 g 左右样品置于陶瓷研钵中，加少许液氮研碎。将粉末转入 400 μL~500 μL 细胞裂解液 离心管中，37 ℃温浴 1 h 后转入 50 ℃水浴 3 h，期间经常摇动。 7.1.2 反应液冷却后加 500 μL 平衡酚，缓慢颠倒 10 min 混匀。12000 rpm 离心 15 min，转上层水相于 新离心管中（重复此过程一次）。 7.1.3 加氯仿/异戊醇 450 μL，混匀后 12000 rpm 离心 10 min。转上层水相于新离心管中，加 1/10 体 积 3 mol/L NaAc 和 2.5 倍体积无水乙醇，混匀，置于-20 ℃环境下 1 h。 7.1.4 12000 rpm 离心 15 min，弃上清。以 70 %冷乙醇洗涤 1~2 次，真空抽干或自然吹干，加入 TE 缓 冲液溶解，-20 ℃保存。 7.2 DNA 检测 7.2.1 纯度检测 吸取1 μL~3 μL DNA，琼脂糖凝胶100 V电泳30 min，如条带整齐、亮度高，则纯度满足实验要求。 7.2.2 浓度检测 分别于260 nm和280 nm波长下测定DNA的紫外吸收值。DNA浓度(μg/mL)=[A260/(0.020×L)]×稀释 倍数，式中L为比色池厚度，单位cm。DNA浓度在10 μg/mL以上时进行后续实验。 8 序列扩增和测序 3 DB21/T 3120—2019 8.1 引物 水产动物PCR扩增引物参见附录A。 8.2 PCR 扩增 PCR扩增应在以下体系和条件下进行： ——PCR 扩增体系：10×PCR 缓冲液 10 μL、上下游引物各 1 μL、DNA 提取液 5 μL、Taq 酶 0.5 μL， dNTP 混合液 8 μL、超纯水定容至 50 μL； ——PCR 扩增条件：一个循环反应（95 ℃ 5 min），30 个循环反应（94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s），72 ℃ 10 min，结束 PCR 反应。 8.3 测序 利用遗传分析仪对PCR产物进行双向测序，得到DNA序列信息。 9 物种鉴定 9.1 序列比对鉴定 将COI基因序列在GenBank和BOLD System中进行核苷酸序列比对，将16S rRNA基因序列在GenBank 中进行核苷酸序列比对。比对结果认定如下： ——序列比对检出标准为序列相似度≥99%； ——综合 COI 和 16S rRNA 的比对结果形成最终鉴定结果； ——若出现 2 个及以上比对结果，则选取相似度高且结果一致的鉴定物种作为鉴定结果； ——对于鉴定成功的样本，记录于《水产动物物种分子鉴定记录表》（见附录 B）； ——对于无匹配结果，或结果矛盾的样本，作为未检出样本处理。 9.2 未检出样本 未检出样本记录于《未检出水产动物分类记录表》（详见附录C）。 4 DB21/T 3120—2019 AA 附 录 A （资料性附录） 水产动物物种分子鉴定 PCR 扩增引物 表A.1 水产动物物种分子鉴定PCR扩增引物 物种 引物序列 硬骨鱼纲 F: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3' 软骨鱼纲 R: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3' 甲壳纲 R: 5'-AGGAAATGTTGAGGGAAGAAAGTAA-3' 双壳纲 F: 5'-ACAAATCAYAARGAYATYGG-3' 腹足纲 R: 5'-ACCAATCATAAAGATATTGG-3' 头足纲 基 因 海参纲 PCR 扩增引 海胆纲 物 海星纲 COI F: 5'-TATTATTAGACAAGAATCTGGTAAA-3' 钵水母纲 哺乳纲 爬行纲 F: 5'-ACAAAYCATAAAGAYATTGG-3' R: 5'-GTAAATATATGRTGGGCTCA-3' F: 5'-ATAATGATAGGAGGRTTTGG-3' R: 5'-GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3' F: 5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGAAC-3' R: 5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3' F: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3' R: 5'-CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3' F: 5'-ACTCAGCCATCTTACCTGTGATT-3' R: 5'-TGGTGGGCTCATACAATAAAGC-3' 通用 F: 5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3' （选用） R: 5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3' 通用 16S rRNA （除甲壳 F: 5'-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-3' 纲和头足 R: 5'-TCCATAGGGTCTTCTCGTC-3' 纲） 基因 PCR 扩 增引物 甲壳纲 头足纲 F: 5'-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-3' R: 5'-TCCATAGGGTCTTATCGTC-3' F: