ICS 65.020 B 15 云 南 省 地 方 标 准 DB53/T 914—2019 甘蔗线条花叶病毒外壳蛋白基因 RT-PCR 检测技术规程 2019 - 05 - 15 发布 云南省市场监督管理局 2019 - 08 - 15 实施 发 布 DB53/T 914—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1－2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由云南省农业科学院甘蔗研究所提出。 本标准由云南省农业标准化技术委员会（YNTC07）归口。 本标准起草单位：云南省农业科学院甘蔗研究所。 本标准主要起草人：单红丽、李文凤、黄应昆、王晓燕、张荣跃、李婕、仓晓燕、罗志明、尹炯。 I DB53/T 914—2019 甘蔗线条花叶病毒外壳蛋白基因 RT-PCR 检测技术规程 1 范围 本标准规定了甘蔗线条花叶病毒外壳蛋白基因的 RT-PCR 检测的仪器和用具、试剂、检测方法和结 果判定等。 本标准适用于甘蔗线条花叶病毒的 RT-PCR 检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 甘蔗线条花叶病毒 甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus，SCSMV) 属于马铃薯 Y 病毒科(Potyviridae) 禾草 病毒属 (Poacevirus)，是引起甘蔗花叶病的主要病毒之一，详见附录 A。 2.2 外壳蛋白基因 外壳蛋白基因(Coat protein genes, cp genes)，是一种合成外壳蛋白的模板，通过转录、翻译合成外 壳蛋白，同病毒的遗传物质构成完整病毒的 RNA 或 DNA 片段。 2.3 RT-PCR 反转录聚合酶链式反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)的简称，是一种在体外利 用反转录酶将 RNA 反转录为 cDNA，再以 cDNA 为模板进行 PCR 反应，以实现扩增 RNA 上特异片段 。 3 仪器和用具 3.1 主要仪器 电子天平，高速冷冻离心机，蛋白/核酸分析仪，PCR扩增仪，涡旋混匀器，微波炉，电泳仪，水平 电泳槽，凝胶成像仪，冰箱。 3.2 用具及耗材 1 DB53/T 914—2019 可调微量移液器，研钵，移液器吸头，离心管，PCR 管。 4 试剂 4.1 常规试剂 液氮，焦碳酸二乙酯（DEPC）水，RNA 提取试剂，三氯甲烷，异丙醇，70%乙醇，无水乙醇。 4.2 RT-PCR 试剂 Oligo (dT) 18 引物（0.5 µg/µL），反转录酶（200 U/µL），RNA酶抑制剂 (40 U/µL)， dNTP 混合 物（10 mmol/L），含染料的Taq DNA 聚合酶混合物（5 U/µL）。 4.3 引物 引物应符合以下要求： a) 引物序列,上游引物 SCSMV-F：5′-ACAAGGAACGCAGCCACCT-3′,下游引物 SCSMV-R：5 ′-ACTAAGCGGTCAGGCAAC-3′； b) 目的扩增片段长度约 940 bp； c) 用灭菌 DEPC 水将上、下游引物分别配制成浓度为 20 μg/μL 的水溶液。 4.4 电泳缓冲液 按以下配制电泳缓冲液： a) 50 ×TAE 储存液：取 242 g Tris，先用 300 mL ddH2O 搅拌溶解后，加 100 mL 0.5 mol/L EDTA 的 水； b) 用冰乙酸调 PH 至 8.0，用 ddH2O 定容至 1000 mL； c) 1×TAE 工作液：用 ddH2O 将储存液稀释 50 倍。 4.5 扩增产物检测试剂 1.5 %（W/V）琼脂糖，0.003%（V/V）Goldenview 核酸染料。 5 检测样 5.1 对照 5.1.1 阳性对照 以经过 RT-PCR 扩增和克隆测序分析为 SCSMV 的样品作为阳性对照。 5.1.2 阴性对照 以经过 RT-PCR 扩增和克隆测序分析为无 SCSMV 的样品作为阴性对照。 5.1.3 空白对照 以灭菌 DEPC 水作为空白对照。 2 DB53/T 914—2019 5.2 取样 采集甘蔗叶片或芽作为待测样品，放入自封袋中，冷藏运输，到实验室液氮速冻后，于-80℃保存 备用。 6 检测方法 6.1 总 RNA 提取 总 RNA 提取步骤如下： a) 取 0.1 g 待测样品置于研钵中，液氮冷冻，研磨至粉状后放入 1.5 mL 离心管中； b) 用 RNA 提取试剂提取样品总 RNA，按提取试剂使用说明书进行操作； c) 提取后用蛋白/核酸分析仪检测 RNA 相对浓度，当 A260/A280 比值为 1.8～2.0 时，于 -80℃保 存备用。 6.2 反转录 按以下步骤进行反转录： a) 以提取的总 RNA 为模板，在 PCR 管中按序依次加入：灭菌 DEPC 水 1.5 μL、dNTP 混合物（10 mmol/L）5 .0 μL、Oligo (dT) 18 引物（0.5 µg/μL）0.5 µL、反转录酶（200 U/µL）0.5 µL、RNA 酶抑制剂 (40 U/µL) 0.5 µL、RNA 模板 2.0 μL 配制成 10 μL 反转录反应体系，混匀； b) 2000 rpm/min 快速离心 10 s，放进 PCR 仪合成 cDNA； c) 42 °C 温育 30 min，85 °C 变性 5 s。 6.3 PCR 扩增 按以下步骤进行 PCR 扩增： a) 以合成的 cDNA 第一链为模板，在 PCR 管中按序依次加入：灭菌 DEPC 水 9.5 μL、含染料的 Taq DNA 聚合酶混合物（5 U/µL）12.5 μL、反转录产物（cDNA）2.0 μL、20 μg/μL 上游引物 SCSMV-F 0.5 μL、20 μg/μL 下游引物 SCSMV-R 0.5 μL 混匀制成 25 μL PCR 反应体系； b) 混匀后 2000 rpm/min 快速离心 10 s，放进 PCR 仪进行 PCR 扩增； c) 反应条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，35 个循环； 72 ℃延伸 10 min。 6.4 琼脂糖凝胶电泳检测 按以下步骤进行： a) b) c) d) 用 1×TAE 缓冲液配制 1.0 %-1.5 %（W/V）琼脂糖胶，加热至琼脂糖完全熔化； 待凝胶冷却至 50 ℃～60 ℃时，在 100 mL 琼脂糖胶中加入 3 μL 的 Goldenview 核酸染料，混匀； 将凝胶倒入制胶板上，插上样品梳； 待凝胶充分冷却后，拔除样品梳，将制胶板同制好的琼脂糖凝胶一并放入装有 1×TAE 缓冲液水 平电泳槽； e) 每个样品取 10 μL PCR 扩增产物加入样品梳孔，在其中一个样品梳孔中加入 6 μL DNA 分子量标 准 (Marker E)，130 V 恒定电压下电泳 25 min； f) 电泳结束后，把胶板取出用凝胶成像仪观察、拍照。 3 DB53/T 914—2019 7 结果判定 RT-PCR 检测结果判定见表 1。 表 1 RT-PCR 检测结果判定 判定条件 RT-PCR 产物在 940 bp 处有无条带出现（见附录 B） 结果判定 序号 空白对照 阴性对照 阳性对照 检测样品 序号 空白对照 阴性对照 阳性对照 检测样品 1 无 无 有 有 检测结果有效，检测样品感染线条花 叶病毒 2 无 无 有 无 检测结果有效，检测样品未感染线条 花叶病毒 有/无 检测结果无效，将实验中的所有试剂 更换，并重新提取检测样品 RNA，进 行 RT-PCR 检测 3 8 有/无 有/无 无 检测报告 依据判定结果给出检测报告，检测报告形式参见附录C。 4 DB53/T 914—2019 AA 附 录 A （规范性附录） 甘蔗线条花叶病毒 A.1 病原特征 A.1.1 病毒粒体 病毒粒体呈弯曲线状，平均大小为890 nm×15 nm。 A.1.2 基因组 基因组由一条正单链 RNA组成，大小约9.7 kb ～10.0 kb，经水解酶切割后可产生11个功能蛋白， 从 N 端到 C 端依次是第一蛋白（P1）、辅助成分-蛋白酶（HC-Pro）、第三蛋白（P3）、P3N-PIPO、 第一个6K 蛋白（6K1）、圆柱状内含体（CI）蛋白、第二个6K 蛋白（6K2）、病毒基因组连接蛋白（VPg）、 核内含体蛋白a蛋白酶（NIa-Pro）、核内含体蛋白 b（NIb）和外壳蛋白（CP）。 A.2 寄主范围 在自然条件下，SCSMV主要侵染甘蔗和高粱；人工接种条件下，还可侵染玉米、谷子、约翰逊草、 苏丹草、毛莨草等禾本科植物。 A.3 分布 主要分布于美国、印度、巴基斯坦、美国、泰国、斯里兰卡、越南、中国以及印度尼西亚等国家。 A.4 病害症状 CSMV 侵染甘蔗引起的花叶病症状与 SCMV 和 SrMV 引起的症状类似，主要表现在叶片上，尤以新 叶最为严重；病毒可扩散至全株，甚至导致整丛蔗株发病。主要是叶绿体被破坏或发展异常而导致叶绿 素含量降低，叶色失绿，产生许多与叶脉平行的黄绿相间不规则嵌纹、条斑或斑驳，大小长短不一，布 满叶片，与正常部分参差间隔成“花叶”；病株生长差、矮化、分蘖减少，汁液量减少。 A.5 传播途径 SCSMV 可通过种茎和苗木等无性繁殖材料远距离传播，也可通过机械摩擦的方式近距离传播，尚未 见蚜虫、螨类传播的报道。 5 DB53/T 914—2019 BB 附 录 B （资料性附录） 甘蔗线条花叶病毒外壳蛋白基因 RT-PCR 检测电泳图 B.1 甘蔗线条花叶病毒外壳蛋白基因 RT-PCR 检测电泳图 M—DNA marker E； 1-5—5 个已感染甘蔗线条花叶病毒的甘蔗样品； 6-10 —5 个未感染甘蔗线条花叶病毒的健康甘蔗样品； PC—SCSMV； NC—健康植株； CK—空白对照 。 图B.1 甘蔗线条花叶病毒外壳蛋白基因RT-PCR检测电泳图 6 DB53/T 914—2019 CC 附 录 C （资料性附录） 甘蔗线条花叶病毒样品检测报告 C.1 甘蔗线条花叶病毒样品检测报告 甘蔗线条花叶病毒样品检测报告见表c.1。 表 c.1 甘蔗线条花叶病毒样品检测报告 样品种类 样品数量 取样时间 取样地点 取样人 送检时间 送检人 联系电话 送检单位 检测时间 检测鉴定方法： 检测鉴定结果： 备注： 检测人（签名）：