ICS 65.020.99 B 05 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 3308—2018 两系杂交水稻种子纯度检测 分子标记法 Protocol for purity detection of two-line hybrid seeds-molecular marker method 文稿版次选择 2018 - 12 - 29 发布 安徽省市场监督管理局 2019 - 01 - 29 实施 发 布 DB34/T 3308—2018 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省种子质量监督检验站提出。 本标准由安徽省动植物检验检疫标准化委员会归口。 本标准起草单位：安徽省种子质量监督检验站、合肥丰乐种业股份有限公司、安徽省种子管理总站、 安徽出入境检验检疫局技术中心。 本标准主要起草人：周桂林、胡晓玲、吴晓亮、曹玉洁、周贤达、张文晓、范家萌、周锐、周红英、 宗凯、张奇、徐丽媛、王凤杰、胡娜、王兆贤、刘根、熊成国、王浩波。 I DB34/T 3308—2018 两系杂交水稻种子纯度检测 分子标记法 1 范围 本标准规定了两系杂交水稻种子纯度分子标记检测的原理、实验步骤、结果分析和报告。 本标准适用于两系杂交水稻种子纯度鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.1 农作物种子检验规程 总则 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.5 农作物种子检验规程 真实性和品种纯度鉴定 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 1433 水稻品种鉴定技术规程 SSR标记法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：base pair，碱基对 CTAB：cetyltrimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵 DNA：deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸 dNTPs：deoxyribonucleoside triphosphates，脱氧核苷三磷酸 PAGE：polyacrylamide gelelectrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR：polymerase chain reaction，聚合酶链式反应 SSR：simple sequence repeat，简单序列重复 Taq 酶：Taq-DNA polymerase，耐热 DNA 聚合酶 ddH2O：双蒸水（超纯水） 4 原理 我国生产上两系水稻的不育基因主要为温敏核不育基因 tms5，其次为光敏核不育基因 pms1、pms3， 根据其对应的特征标记在品种中的等位基因型，可判断该品种是否为两系杂交水稻或不育系。同时，水 稻的不同品种，其基因组存在着能够世代稳定遗传的重复次数不同的简单重复序列(SSR)，且 SSR 标记 具有共显性，杂交种子具有双亲等位标记互补带型，针对不同品种筛选其区别于其它品种的特征 SSR 标记，通过 SSR 多态性分析，可判断受检种子是否为杂交种并区别正常个体与异品种个体。本标准综 合利用两系不育基因特征标记和不同品种特征 SSR 标记，鉴定一定数量送验样品中的正常个体数目或 百分率，从而对整体样品的一致程度作出评价。 1 DB34/T 3308—2018 5 仪器设备 高压灭菌锅、超纯水仪、高速离心机、恒温水浴锅（30℃～100℃）、核酸蛋白测定仪、组织研磨 仪、PCR 扩增仪、高压电泳仪、垂直电泳槽及制胶附件、微量可调加样器（2 μL、10 μL、100 μL、1000 μL）。 6 试剂和溶液配制 所用试剂均为分析纯，试剂配制用水应符合 GB/T 6682 规定的一级水的要求。 6.1 试剂 6.1.1 DNA 提取 十六烷基三甲基溴化铵、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、盐 酸、氢氧化钠、氯化钠。 6.1.2 PCR 扩增 2+ 引物、DNA、dNTPs、Taq 酶、10×Buffer 缓冲液、ddH2O、和 Mg 或者 Mix 反应混合液。 6.1.3 PAGE 电泳 去离子甲酰胺、溴酚蓝、二甲苯青 FF、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、硼酸、尿素、亲和硅烷、剥 离硅烷、DNA 分子量标准、无水乙醇、四甲基乙二胺、过硫酸铵、冰醋酸、硝酸银、甲醛、氢氧化钠。 6.2 溶液配制 见附录A。 7 实验步骤 7.1 取样 从送检样品中分取规定数量的试样，试样采用单个个体独立检测。试样的抽取应有代表性，符合 GB/T 3543.2 的规定。 试样的检测应设置重复，重复的次数以达到 GB/T 3543.5 规定的容许误差范围内为止，每次重复 的数量应至少含有 90 粒种子。 7.2 7.2.1 DNA 提取 CTAB 法 取待检样品的去壳种子、幼苗或叶片约 200～300 mg 置于 2.0 mL 离心管，充分研磨；每管加入 700 µL 经 65℃预热的 CTAB 提取液，充分混合，65℃水浴 30 min，期间多次颠倒混匀；每管加入等 体积的氯仿/异戊醇（24:1）混合液，充分混合后静置 10 min；10000 g 离心 10 min，吸取上清液 300 µL 转移至一新管，加入 600 µL 预冷 95％乙醇，颠倒混匀，-20℃冷冻 30 min；10000 g 离心 10 min， 弃上清液，用 70％乙醇溶液洗涤 2 遍；室温自然晾干后，加入超纯水或 TE 缓冲液 400 µL，充分溶 解；检测浓度后备用。 2 DB34/T 3308—2018 7.2.2 碱煮法 将种子发芽至幼苗长度达到 3 cm 左右时剪取 0.5 cm 长的幼苗，或将田间植株的叶片剪取 0.5 cm×0.5 cm 大小，放入 96 孔深孔板中。每孔加入 40 μL 氢氧化钠提取液，沸水加热 1 min，然后加 入 60 μL TE 缓冲液，沸水加热 2 min。放在 4℃冰箱备用。 7.3 7.3.1 PCR 扩增 DNA 样品 在两个 96 孔 PCR 扩增板中分别加入待检样品的 94 个单样 DNA 和两个对照样品的 DNA，对照样 品分别为父、母本的 DNA 各 1 个或标准样品的 DNA 2 个。 7.3.2 引物 每个两系杂交水稻品种至少筛选 2 对引物进行纯度鉴定，包括针对该品种不育基因类型 （tms5/pms3/pms1）的 1 对特征引物（见表1），以及根据 NY/T 1433 中 48 对引物筛选出的品种鉴 别力强且在父母间具有多态性的 1 对以上特征 SSR 引物（见表2），并综合 2 对以上引物的检测结果 判定异品种类型（自交、异交、混杂）。 表1 不育 检测 引物 基因 引物 编号 tms5 tms5-1 A1 检测两系不育基因的特征引物序列及等位基因型 引物序列 F: ATGGCCTCGTCGAGTTCTAA 含有 tms5 基因的品种较不含 tms5 基因 R: CGGTCAGCTGAATTTCTCTGT 的品种扩增产物片段小。 F:AGGCATGGTGAAGCAAAGAAGTG pms3 pms3-1 A2 R: TGAAGCGGCGGCTCCGTTAT M:GAAGCAAAGAAATGCATTGTTTGTG pms1 pms1-1 A3 等位基因型 含有 pms3 基因的品种较不含 pms3 基因 的品种扩增产物片段小。 F: AGGCGCAGTAAAAACACCTG 含有 pms1 基因的品种较不含 pms1 基因 R: CTTGCGTGGTTTCAAGGG 的品种扩增产物片段大。 表2 引物编号 引物名称 B1 RM336 B2 RM481 B3 RM258 B4 RM224 B5 RM8277 B6 OSR28 特征 SSR 引物序列 引物序列 F:CTTACAGAGAAACGGCATCG R:GCTGGTTTGTTTCAGGTTCG F:TAGCTAGCCGATTGAATGGC R:CTCCACCTCCTATGTTGTTG F:TGCTGTATGTAGCTCGCACC R:TGGCCTTTAAAGCTGTCGC F:ATCGATCGATCTTCACGAGG R:TGCTATAAAAGGCATTCGGG F:AGCACAAGTAGGTGCATTTC R:ATTTGCCTGTGATGTAATAGC F:AGCAGCTATAGCTTAGCTGG R:ACTGCACATGAGCAGAGACA 3 DB34/T 3308—2018 表 2（续） 7.3.3 引物编号 引物名称 B7 RM21 B8 RM424 引物序列 F:ACAGTATTCCGTAGGCACGG R:GCTCCATGAGGGTGGTAGAG F:TTTGTGGCTCACCAGTTGAG R:TGGCGCATTCATGTCATC PCR 反应体系 反应体系的总体积和组分的终浓度按照附录B 进行配量，可以依据试验条件不同作相应调整。缓冲 液若含有 MgCl2，不再加 MgCl2 溶液，加等体积无菌水替代。 7.3.4 PCR 反应程序 预变性：94℃ 4 扩增：94℃变性 终延伸：72℃ 5 扩增产物加入 2 7.4 min； 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，进行 32 次循环； min。 L 上样指示剂后于 4℃保存。 扩增产物 PAGE 电泳检测 扩增产物基因型可用 PAGE 电泳或毛细管电泳检测，毛细管电泳检测方法参照相应毛细管电泳仪的 操作规程，本标准宜使用 100 孔垂直电泳槽进行 PAGE 电泳检测的方法。 7.4.1 凝胶制备 沾洗涤灵用清水将玻璃板反复擦洗干净，晾干后用 95％乙醇擦洗两遍；将 1 mL 亲和硅烷工作液 均匀涂在无凹槽的玻璃板上，两侧对齐放置塑料边条，将 1 mL 剥离硅烷均匀涂在带凹槽的玻璃板上， 涂有剥离硅烷的一面朝下盖于无凹槽玻璃板上，两侧对称夹上夹子；将 65 mL 4％聚丙酰胺凝胶（现配 现用）缓慢注入两玻璃板之间，灌胶过程应防止气泡的出现。待胶室灌满后，在凹槽处将鲨鱼齿朝外轻 轻插入样品梳，在室温下聚合 1 h 以上。 7.4.2 电泳 拔下玻璃板上的样品梳，用清水洗净点样槽，再将玻璃板装上电泳槽，上下槽注入 0.5×TBE 缓冲 液，并使其没过凹槽玻璃板。用移液器吹掉加样孔内的气泡和杂质，插入 100 孔样品梳（鲨鱼齿朝下），