11.220 ICS B 41 DB21 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21/T 3094—2018 种猪场欧洲型猪蓝耳病净化技术规范 The technical specifications for removing european genotype porcine reproductive and respiratory syndrome in breeding pig farm 2018 - 12 - 25 发布 辽宁省市场监督管理局 2019 - 01 - 25 实施 发 布 DB21/T 3094—2018 目 前 次 言 ............................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 3.1 欧洲型猪蓝耳病 ................................................................ 1 3.2 可疑感染猪群 .................................................................. 1 3.3 假定健康猪群 .................................................................. 1 4 净化群的建立 ...................................................................... 1 4.1 采样数量和采样时间 ............................................................ 1 4.2 检测方法 ...................................................................... 2 4.3 处理 .......................................................................... 3 5 净化群的维持 ...................................................................... 4 5.1 5.2 5.3 5.4 日常检测 ...................................................................... 后备猪的检测 .................................................................. 引进猪只的检疫 ................................................................ 病死猪的检测 .................................................................. 4 4 4 4 6 净化场的认定 ...................................................................... 4 7 净化场的维持 ...................................................................... 4 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 引进猪只的检疫 ................................................................ 病死猪的检测 .................................................................. 人员和车辆等物品的消毒 ........................................................ 场内及舍内环境的消毒 .......................................................... 无害化处理措施 ................................................................ 杀虫防蝇灭鼠措施 .............................................................. 4 4 4 5 5 5 附录 A（规范性附录） 附录 A .......................................................... 6 I DB21/T 3094—2018 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则并起草。 本标准由辽宁省畜牧兽医局提出并归口。 本标准起草单位：锦州医科大学、辽宁省动物卫生监测预警中心、锦州市动物疫病预防控制中心等 单位。 本标准主要起草人：李冰、刘全、高慎阳、刘英姿、陈勇、李宁、张建平、马强、赵岩、田苗、张 娜、夏伟、邵奎龙、路畅、李红伟、郭雪峰、孙洪广、刘宏艳、李强、刘晓宇、王军、徐畅、何礼。 II DB21/T 3094—2018 种猪场欧洲型猪蓝耳病净化技术规范 1 范围 本标准规定了种猪场欧洲型猪蓝耳病净化的术语和定义、检测方法与判定标准、净化群的建立、净 化群的维持、净化场的认定和净化场的维持。 本标准适用于种猪场欧洲型猪蓝耳病净化工作。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 27517 鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR方法 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 NY/T 1168 畜禽粪便无害化处理技术规范 3 术语和定义 3.1 欧洲型猪蓝耳病 欧 洲 型猪 蓝耳 病（ European Genotype Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome ； EU-PRRS）：由欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒引起猪的一种高度接触性传染病，该病不但引起猪只免 疫抑制，母猪流产，也可引起仔猪死亡，同时影响高致病性猪蓝耳病的防控工作，是世界上危害养猪业 最严重的传染病之一。 3.2 可疑感染猪群 可疑感染猪群（Suspiciously infected swine herd）：未发现任何症状，但与患病猪群及其污染 的环境有过明显接触的猪群，称为可疑感染猪群。 3.3 假定健康猪群 假定健康猪群（Hypothesis of healthy swine herd）：除了患病猪群和可疑感染猪群外，疫区其 他易感猪群都属于假定健康猪群。 4 净化群的建立 4.1 采样数量和采样时间 4.1.1 假定健康猪群 1 DB21/T 3094—2018 种公猪按100%比例采血，或同时按100%比例采集精液，连续采集2次，间隔14天。种母猪按25%比例 采血，或同时采集活体扁桃体，连续采集2次，间隔14天。 4.1.2 可疑感染猪群 种公猪、种母猪分别按100%比例采血，或同时按100%比例采集精液，连续采集2次，间隔14天。 4.1.3 感染猪群 种公猪、种母猪、后备猪分别按100%比例采血，或同时按100%比例采集精液，连续采集2次，间隔 14天。 4.2 检测方法 4.2.1 检测试剂和仪器 本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分 装，水为符合GB/T 6682-1992标准的灭菌双蒸水或超纯水。 本技术规范中需应用下列试剂和材料：Trizol（RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中， 于4℃～8℃保存）、氯仿（4℃预冷）、异丙醇（4℃预冷）、75%乙醇（用新开启的无水乙醇和DEPC水 配制，－20℃预冷）、DEPC水（1000mL双蒸水中加入1mL DEPC，室温下持续搅拌过夜，121℃高压灭菌 25min）、RNA酶抑制剂（40 U/μL）、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、dNTP(2.5 mmol/L)、AMV反转录酶（5 U/μL）、三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液（TAE）、溴化乙锭（EB）、DL2000 DNA Marker、上游引 物：5ˊ-TAACCGAGCATACGCTGTGAGAAAG-3ˊ，下游引物：5ˊ-CAAATTAACTTGCACCCTGACTGGC-3ˊ。 本技术规范中使用的设备包括：PCR扩增仪，高速冷冻离心机（离心力在12000g以上），核酸电泳 仪和水平电泳槽，组织均浆机或研钵，凝胶成像系统、微量移液器。 4.2.2 样品的采集与处理 4.2.2.1 组织样品：按照 GB/T 27517 标准中关于组织样品处理方法执行。采集时应釆取有明显病变的 淋巴结、扁桃体、肺脏、脾脏、肾脏、胸腺等组织样品。用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品 0.5g 左右 于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，再加 0.3mL～0.5mL PBS 混匀，然后将组织悬液转入无菌 Eppendorf 管中，4℃条件下 5000r/min 离心 10min，取上清液转入新的无菌 Eppendorf 管中，编号备用。 4.2.2.2 血清或抗凝血：用无菌注射器自耳静脉或前腔静脉釆集血液 3mL～5mL，待血清析出后直接吸 取血清至无菌 Eppendorf 管中，血清量不少于 0.5mL，编号备用；用无菌注射器先吸入抗凝剂（阿氏液） 2mL～3mL，再自耳静脉或前腔静脉采集等量血液快速混匀后转入无菌 Eppendorf 管中，编号备用。 4.2.2.3 存放与运送：采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。采集或