ICS 11.220 B 41 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2909—2018 H5N8 亚型禽流感病毒 HA 和 NA 基因荧光 RT-PCR 检测方法 Method of the real-time PCR for the detection of HA and NA genes of Avian influenza subtype H5N8 2018 - 11 - 12 发布 吉林省市场监督管理厅 2018 - 12 - 30 实施 发 布 DB22/T 2909—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。 本标准由长春海关（原吉林出入境检验检疫局）提出并归口。 本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。 本标准主要起草人：王伟利、姚贵哲、孟庆峰、刘金华、王岸英、王准、肖芳、马玲。 I DB22/T 2909—2018 H5N8 亚型禽流感病毒 HA 和 NA 基因荧光 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了H5N8亚型禽流感病毒HA和NA基因荧光RT-PCR检测方法的原理、材料与试剂、仪器设备、 样品、试验步骤和试验数据处理技术要求。 本标准适用于H5N8亚型禽流感病毒HA和NA基因检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 19438.1 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件 RT-PCR： 反转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction） Ct值：每个反应管内的荧光信号达到的设定的阈值时所经历的循环数（Cycle threshold） RNA：核糖核酸（Ribonucleic Acid） DEPC：焦磷酸乙二酯（Diethy pyrocarbonate） HA： 血凝素（hemagglutinin） NA： 神经氨酸酶（neuraminidase） Taq 酶：Taq 脱氧核糖核酸聚合酶（Thermusaquaticus DNA polymerase） 4 原理 根据H5N8亚型禽流感病毒HA基因和NA基因序列设计引物和探针，探针结合部位在扩增片段内部。HA 基因和NA基因探针分别在5’端标记VIC和FAM荧光素作为报告荧光基团，3’端分别标记MGB和BHQ1作为淬 灭荧光基团。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上荧光基团发出的 荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥5’→3’的 外切核酸酶功能，将探针降解。探针上的荧光基团游离出来，所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收而被 检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。据此荧光PCR 仪可实现对HA基因和NA基因的同步实时检测。 5 材料与试剂 5.1 5.1.1 材料 离心管（1.5 mL、0.2 mL）。 1 DB22/T 2909—2018 5.1.2 5.2 荧光 PCR 反应管。 试剂 5.2.1 裂解液 5.2.2 阴性对照：可采用健康的动物组织材料或经灭活的不含禽流感病毒的鸡胚尿囊液。 5.2.3 阳性对照：非感染性体外转录 RNA，-20 ℃保存备用。 5.2.4 氯仿（分析纯）。 5.2.5 异丙醇（分析纯）。 5.2.6 75%乙醇。 5.2.7 DEPC 水：0.1% DEPC 处理后的去离子水。 5.2.8 2×RT-PCR Buffer 5.2.9 RT Enzyme Mix 5.2.10 Taq 酶 5.2.11 引物与探针： HA 基因： 引物 F1 ：5’–CTTGCGACTGGGCTCAGAAAT–3’； 引物 R1 ：5’–TTTGGGTGGATTCTTTGTCTGC–3’； 探针 P1 ：VIC-CATTCCTTGCCATCC-MGB； NA 基因： 引物 F2 ：5’-CTCCAAGAGGGGAAGATGCT -3’； 引物 R2 ：5’-CTGACCTGGAGGTTCGACTA–3’， 探针 P2：FAM-CGCCCCACCCACACATCAGTTCCCTGT-BHQ1， 6 仪器设备 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 7 旋涡振荡器。 高速冷冻离心机。 微量可调移液器 (10 µL、100 µL、1 000 µL)。 超低温冰箱（-80 ℃）。 荧光定量 PCR 仪。 样品 抽样按照 GB/T 19438.1 规定执行。 8 试验步骤 8.1 8.1.1 核酸抽提 酚氯仿法 8.1.1.1 取灭菌的 1.5 mL 离心管（5.1.1），做好标识。 8.1.1.2 每管加入 600 µL 裂解液，分别加入被检样本、阴性对照（5.2.2）、阳性对照（5.2.3）各 200 µL，再加入 200 µL 氯仿（5.2.4），旋涡振荡器（6.1）充分振荡混匀，置高速冷冻离心机（6.2） 4℃ 12 000 r/min 离心 15 min。 2 DB22/T 2909—2018 8.1.1.3 取灭菌的 1.5 mL 离心管（5.1.1），加入-20 ℃预冷 400 µL 异丙醇（5.2.5），吸取 8.1.2 各管中的上清液转移至相应的离心管（5.1.1）中，避免吸出中间层，颠倒混匀，置高速冷冻离心机（6.2） 4 ℃ 12 000 r/min 离心 15 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入 600 µL 75%预冷乙醇（5.2.6）， 颠倒洗涤。 8.1.1.4 置高速冷冻离心机（6.2） 4℃ 12 000 r/min 离心 10 min，弃上清。 8.1.1.5 将 8.1.4 中离心管 10 000 r/min 离心 10 s，用微量可调移液器（6.3）吸干剩余液体，室温 干燥 5 min～10 min。 8.1.1.6 加入 15 µL DEPC 水（5.2.7），溶解管底的 RNA，冰上保存备用，若需长期保存应放置超低 温冰箱（-80 ℃）（6.4）。 8.1.2 其他方法 采用等效RNA提取试剂及方法或采用自动化核酸抽提仪和配套核酸抽提试剂进行核酸抽提。 8.2 8.2.1 荧光 RT-PCR 检测 荧光 RT-PCR 反应体系 在PCR溶液配制区，反应体系配制见表1与表2，每份检测样品的荧光RT-PCR体系为25 µL。用旋涡 振荡器进行混匀，瞬间离心后置荧光PCR仪扩增。 表1 H5N8 亚型禽流感病毒 HA 基因荧光 PCR 反应体系 成分 用量 µL 2×RT-PCR Buffer（5.2.8） 12.5 RT Enzyme Mix 5 U/µL（5.2.9） 1.0 Taq 酶 5 U/µL（5.2.10） 1.0 F1 20 µmol/L（5.2.11） 1.0 R1 20 µmol/L（5.2.11） 1.0 P1 15 µmol/L（5.2.11） 1.0 模板 RNA 5.0 DEPC水（5.2.7） 2.5 表2 H5N8 亚型禽流感病毒 NA 基因荧光 RT-PCR 反应体系 成分 用量 µL 2×RT-PCR Buffer（5.2.8） 12.5 RT Enzyme Mix 5 U/µL（5.2.9） 1.0 Taq 酶 5 U/µL（5.2.10） 1.0 F1 20 µmol/L（5.2.11） 1.0 R1 20 µmol/L（5.2.11） 1.0 P1 15 µmol/L（5.2.11） 1.0 模板 RNA 5.0 DEPC水（5.2.7） 2.5 8.2.2 荧光 RT-PCR 反应参数 3 DB22/T 2909—2018 第1阶段，42 ℃ 30 min。第2阶段，95 ℃ 10 s。第3阶段，95 ℃ 10 s、57 ℃ 20 s（在此收集 荧光）、40个循环。 9 试验数据处理 9.1 结果分析条件设定 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根 据仪器噪音情况进行调整。 9.2 质控标准 9.2.1 9.2.2 9.2.3 9.3 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。 阳性对照的 Ct 值应≤32.0，并出现特定的扩增曲线。 如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此实验视为无效。 结果判定及报告 9.3.1 阴性 无Ct值且无扩增曲线，或只出现单一通道有荧光信号，均判为阴性。报告样品中未检出 H5N8 亚型 禽流感病毒。 9.3.2 阳性 Ct均≤32.0，且HA基因与NA基因同时扩增出特定的扩增曲线，判为阳性，报告样品中存在H5N8亚型 禽流感病毒。 9.3.3 有效原则 Ct＞32.0的样本建议重做，重做结果无Ct者为阴性，否则为阳性。 A _________________________________ 4