ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T41627—2022 动物源空肠弯曲菌检测方法 Detection method of Campylobacter jejuni from animal samples 2023-02-01实施 2022-07-11发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T41627-—2022 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任， 本文件由中华人民共和国农业农村部提出。 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本文件起草单位：扬州大学、中国动物卫生与流行病学中心。 本文件主要起草人：焦新安、黄金林、唐苑悦、王娟、任方哲、李凤鸣、曲志娜、宋召军、赵思俊 张纯萍。 1 GB/T 41627—2022 动物源空肠弯曲菌检测方法 1范围 本文件描述了动物源空肠弯曲菌（Campylobacterjejuni）多重PCR的检测方法。 本文件适用于畜禽养殖和屠宰过程中动物源空肠弯曲菌的检测。 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 本文件。 GB4789.9—2014食品安全国家标准食品微生物学检验 金空肠弯曲菌检验 NY/T1948兽医实验室生物安全要求通则 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CFU：菌落形成单位（Colony-formingunit） DMSO：二甲基亚矾（Dimethylsulfoxide） DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid） EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid) mCCDA：弯曲菌选择性琼脂（Modifiedcharcoalcefoperazonedeoxycholateagar) MHA：MuellerHinton琼脂(MuellerHinton agar) PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline） PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction） TBE：Tris-硼酸盐-EDTA（Tris-Borate-EDTA） 5设备和材料 5.1 冰箱：冷藏温度为2℃~8℃。 5.2 恒温培养箱：37℃±1℃、42℃±1℃。 5.3 高压灭菌锅：灭菌温度为121℃，工作压力为0.1MPa。 5.4 恒温振荡培养箱：180r/min、42℃土1℃。 5.5 微需氧培养装置：5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气。 5.6 无菌棉签。 1 GB/T41627—2022 5.7 无菌采样袋：12cm×18cm、45cm×55cm。 5.8 无菌采样瓶：1L、50mL。 5.9 无菌采样管：5mL、50mL。 5.10 运输蛋托。 5.11 无菌剪刀。 5.12 无菌镊子。 5.13 无菌平皿。 5.14 无菌接种环：1μL。 5.15 均质器与配套均质袋 5.16 电子天平。 5.17 过滤装置及滤膜（0.22μm）。 5.18 无菌滤纸。 5.19 离心机：转速≥12000r/min。 5.20 1.5mL离心管。 5.21 空肠弯曲菌标准株NCTC11351。 5.22 干式恒温金属浴。 基因扩增仪。 5.23 5.24 PCR管。 5.25 点样梳。 5.26 制胶槽。 5.27 凝胶成像仪。 6 培养基与试剂 6.1 mCCDA：见附录A中A.1。 6.2 MHA血平板：见A.2。 6.3 Bolton肉汤：见A.3。 6.4 Cary-Blair运输培养基：见A.4。 6.5 多重PCR反应体系：见A.5。 6.6 PBS:见A.6。 6.7 0.1%蛋白陈水：见A.7。 6.8 灭菌超纯水。 6.9 0.5XTBE电泳缓冲液：见A.8。 6.10 1.2%琼脂糖凝胶：见A.9。 6.11 核酸染料。 6.12 介于100bp~2000bp的DNA分子量标准 6.13 10XDNA凝胶加样缓冲液。 7 生物安全要求 采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守NY/T1948的有关规定。 2 GB/T41627—2022 检验程序 空肠弯曲菌检验程序见图1。 样品采集 家食养殖场 家省养殖场 泄殖腔棉拭子 直肠棉拭子 饲料 禽蛋 养殖环境 饲料 鲜奶 养殖环境 肠内容物 肉样品 宰场环境 或粪便拭了 或粪便拭了 增菌 增菌 增菌 42"C±1°℃ 42°C±1C， 42C±1 微需氧 微需氧 24h~48h 24 h~48 h 选择性培养基分离 37±1C或 42"C±1"℃, 微需氧 24 h48 h 弯曲菌属的生化鉴定 弯曲菌的多重PCR鉴定 空肠弯曲菌的生化鉴定 空肠弯曲菌 图1动物源空肠弯曲菌检测程序 9操作步骤 9.1样品采集 9.1.1家禽泄殖腔或家畜直肠棉拭子样品 用无菌棉签采集家禽泄殖腔内或家畜直肠内粪便约o.1g，放人Cary-Blair运输培养基中保存。 9.1.2 家禽或家畜粪便拭子样品 用无菌棉签采集家禽或家畜的新鲜粪便约0.1g，放人Cary-Blair运输培养基中保存。 9.1.3禽蛋样品 9.1.3.1 禽蛋蛋黄液或蛋浆样品 将禽蛋样品分别放人无菌采样袋中，固定在运输蛋托中保存，在无菌条件下吸取蛋黄液或蛋浆。 9.1.3.2禽蛋表面擦拭样 用无菌棉签擦拭禽蛋表面，放入无菌采样袋中封口保存 3 GB/T41627—2022 9.1.4鲜奶样品 用无菌采样袋或无菌采样管采集鲜奶样品约50mL，封口保存 9.1.5饲料样品 用无菌镊子夹取养殖场贮藏的饲料或垫料10g，分别放入无菌采样袋中封口保存。 9.1.6养殖环境样品 9.1.6.1环境擦拭样 用无菌棉签擦拭养殖环境的地面、参与养殖人员的鞋底，放入无菌采样袋中封口保存， 9.1.6.2饲料和垫料样品 用无菌镊子夹取养殖环境中的饲料和垫料10g，分别放无菌采样袋中封口保存。 9.1.7水样品 取养殖场家禽或家畜的饮用水1L～4L和养殖环境中的污水20mL50mL，放入无菌采样瓶中 保存。 9.1.8肠内容物棉拭子样品 用无菌剪刀剪开盲肠，用无菌棉签采集肠道内容物，放入Cary-Blair运输培养基中保存 9.1.9屠宰肉样品 9.1.9.1 肉表面擦拭样品 用无菌棉签擦样品的表面（面积至少100cm），放人无菌采样袋中封口保存。 9.1.9.2大块肉样品 用无菌采样袋采集大块肉样品约100g，封口保存。 9.2 样品运输 样品运输过程中，应避光保存，保存温度为0℃～20℃，样品应在24h内进行处理。如果采样与 样品处理的间隔时间较长，样品应在4℃土2℃中低温保存，并在72h内进行处理。 9.3样品处理及增菌 9.3.1泄殖腔或直肠棉拭子、粪便棉拭子及肠内容物棉拭子样品处理 将棉拭子插人装有1mLPBS的1.5mL离心管内浸泡20min，振荡数次，至眼观粪渣完全重悬，立 48 h。 9.3.2禽蛋蛋黄液或蛋浆样品处理 取25mL蛋黄液或蛋浆样品加入125mLBolton肉汤中均质混合（1：6稀释），取25mL混合液加 人100mLBolton肉汤中并混勾（1：30稀释），同时将1：6和1：30稀释的混合液分别置于恒温振荡 4 GB/T41627—2022 培养箱中，42℃士1℃微需氧条件下培养24h~48h，进行增菌。 9.3.3鲜奶样品处理 将50mL鲜乳样品在4℃下10000r/min离心30min后弃去上清液，用10mLBolton肉汤重悬 沉淀（尽量避免带人油层），将悬浊液转移至90mLBolton肉汤中，置于恒温振荡培养箱中，42℃士 1℃微需氧条件下培养24h48h，进行增菌。 9.3.4表面擦拭样品处理 用无菌剪刀将禽蛋、肉表或环境表面擦拭样的棉签头直接剪落到1o0mLBolton肉汤中，置于恒温 9.3.5大块肉样品处理 将200mL0.1%蛋白陈水加入样品采样袋中，振荡2min~3min，充分冲洗样品。将处理后的 0.1%蛋白陈水重悬沉淀，吸取3mL悬浊液，加人100mLBolton肉汤中，置于恒温振荡培养箱中， 42℃±1℃微需氧条件下培养24h~48h，进行增菌。 9.3.6饲料和垫料样品处理 10omL均质液加入90mLBolton肉汤中，置于恒温振荡培养箱中，42℃土1℃微需氧条件下培养 24h48h，进行增菌。 9.3.7水样品处理 用o.22um滤膜过滤水样进行富集，并将富集后的滤膜置于5mLBolton肉汤中；或将水样在 4℃条件下5000r/min离心10min，去除上清液后，加人5mLBolton肉汤将沉淀物重悬。处理后的 样品置于恒温振荡培养箱中，42℃士1℃微需氧条件下培养24h～48h，进行增菌。 9.3.8样品增菌后处理 用PBS将24h增菌液和48h增菌液分别进行1：50的稀释，将100μL增菌液及对应的1：50稀 释液分别划线接种于弯曲菌选择性mCCDA平板上，置于恒温培养箱中，42℃士1℃微需氧条件下培 养24h~48h。 9.4弯曲菌的分离 观察24h培养与48h培养的琼脂平板上的菌落形态，弯曲菌在mCCDA平板上的疑似菌落通常 为淡灰色、有金属光泽、潮湿、扁平，皇扩散生长的倾向。挑取疑似弯曲菌的单菌落·接种于MHA血平 板上，在37℃士1℃或42℃士1℃微需氧条件下培养24h~48h。 将空肠弯曲菌标准株NCTC1