ICS 11.220 CCS B 41 5304 玉溪市 地方标准 DB 5304/T 059—2023 动物疫病监测采样技术规范 2023 - 04 - 20发布 2023 - 07 - 19实施 玉溪市市场监督管理局 发布 DB 5304/T 059 —2023 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由 玉溪市动物疫病预防控制中心 提出。 本文件由玉溪市农业农村局归口。 本文件起草单位：玉溪市动物疫病预防控制中心 本文件主要起草人： 杨耀兰、吕嵘、宋诗雅、罗晓燕、杨秋楠、李晶、徐聪、张晓舟、赵明丽、吴 明伟、荚洪涛、杨曦、魏建宏。 DB 5304/T 059 —2023 1 动物疫病监测采样技术规范 1 范围 本文件规定了动物疫病监测样品的采样原则、 采样准备、 样品采集与处理、 样品记录、 样品保存、 样品运送与包装、 废弃物无害化处理等技术内容。 本文件适用于兽医诊断、疫情监测、畜禽疫病防控和免疫效果评价等动物疫病实验室检测所需样品 （病料）的采集、保存和运送。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期 的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 动物疫病监测 调查动物群体中某种疫病或病原的存在情况。 3.2 样品 取自动物或环境，拟通过检测反映动物个体、群体或环境有关状况的材料或物品。 3.3 采样 按照规定的程序和要求，从动物或环境取得一定量的样本，并经过适当的处理，留做待检样品的过 程。 4 采样原则 —— 急性死亡的患畜，怀疑患有炭疽时，先排除炭疽后，再进行解剖取样。 —— 诊断或被动监测时， 根据不同疫病或检测目的， 采集 1～3头 （只） 病死或濒死动物相应样品， 病料必须具有代表性（见附录 A）。 DB 5304/T 059 —2023 2 —— 用于流行病学调查、抗体监测、动物群体健康评估等样品，数量、种类、分布等要满足流行 病学调查和生物统计学的要求。 —— 采集死亡动物病料，应于动物死亡后 2小时内采集；无法完成时，夏天不得超过 6小时，冬 天不得超过 24小时。 —— 采样过程应注意无菌操作，所需器具均应事先严格灭菌。 —— 活体动物采样时，应避免过度刺激或损害动物。 —— 做好个人安全防护、环境消毒和病害肉尸的无害化处理。 5 采样准备 人员准备 5.1 采样人员应熟练 掌握采样工作程序和采样操作技术，做好个人安全防护。 器械和物品 5.2 5.2.1 保定器械 保定器（绳）、牛鼻钳、口笼等。 5.2.2 工具物品 采样箱（或冷藏箱）、解剖刀、手术剪、镊子、钢锯、骨剪、探杯、酒精灯、酒精棉、注射器、一 次性采血针、离心管、试管、试管架、平皿、样品袋、玻片、无菌棉拭子、冰袋、封条、废弃物袋等。 5.2.3 防护用品 防护服、防护帽、口罩、手套、胶鞋、护目镜、消毒药、喷壶等。 5.2.4 记录用品 采样单、记号笔、签字笔、不干胶标签、记录本等。 保存液 5.3 25%～50%甘油生理盐水（加双抗）、阿氏液、 PBS液等（附录 C ）。 6 样品采集与处理 血液样品 6.1 6.1.1 采血部位 —— 猪：前腔静脉、耳缘静脉、股静脉、前肢隐静脉采血； —— 禽类：翅静脉、心脏、颈静脉采血； —— 牛、羊、马：颈静脉、尾静脉、耳缘静脉、乳房静脉采血； —— 犬、猫：前臂头静脉、颈静脉采血； —— 兔：耳背静脉、颈静脉或心脏采血； —— 啮齿类动物：尾尖采血、眼窝内的血管丛采血。 DB 5304/T 059 —2023 3 6.1.2 血样处理 6.1.2.1 血清样品 分离血清的样品不加抗凝剂，采集全血 3~5mL置于采血管中 ，在室温（ 20℃~25℃）静置，待血液 凝固，血清自然析出或进行离心分离，收集备用。若需长时间保存，应将血清置 -20℃以下保存，且应 避免反复冻融。 6.1.2.2 全血样品 采样前样品容器中加入抗凝剂，充分摇匀，低温备用。抗凝剂可用乙二胺四乙酸（ EDTA，PCR检测 血样首选抗凝剂）、 0.1%肝素钠、阿氏液（见附录 C.1，2份阿氏液可抗 1份血液）、 3.8%～4%枸橼酸钠 溶液（0.1mL可抗1mL血液）等。全血样品采集 3~5mL。 6.1.2.3 血浆样品 样品容器内先加入抗凝剂（同全血样品），采集全血 3~5mL后摇匀，然后静置，待红细胞自然下沉 或离心沉淀后，取上清液即为血浆。 组织样品 6.2 6.2.1 病原分离样品 以无菌技术采集淋巴结、肝脏、肾、脾、胰腺、心、肺等组织样品（大约 2cm3～5cm3），分别放入 灭菌容器或样品袋内。 6.2.2 组织病理学样品 选取典型、明显的病变部位，连同健康组织一同切下，立即放入不低于 10倍于组织块的 10%福尔 马林溶液（ 见附录 C.7）中固定。固定器具避免使用金属材质，组织块厚度不超过 0.5cm，体积在 2cm3～ 3cm3。组织块切忌挤压、刮摸和用水洗。如作冷冻切片用，则将组织块放在 0℃～4℃容器中，尽快送往 实验室。 6.2.3 猪扁桃体样品 用开口器打开猪口腔，将活体采样器的采样钩紧靠扁桃体，扣动扳机取出扁桃体组织 2g。 6.2.4 皮肤组织及其附属物样品 6.2.4.1 上皮组织或水泡皮 无菌采集 2g病变的上皮组织或水泡皮（坏死组织、痂皮、丘疹、结节、脓包等）置于 25%～50%甘油 生理盐水缓冲液（加双抗） （见附录C.6）。未破裂的水泡，用灭菌注射器或其他器具抽取水泡液，装 入灭菌容器中送检。若水泡皮表面有污物，用清水清洗，切忌使用酒精、碘酒等消毒剂消毒、擦拭。 6.2.4.2 毛发和绒毛样品 拔取毛发或绒毛样品，用于检查体表的螨虫、跳蚤和真菌感染。用解剖刀片沿边缘刮取的表层皮屑 2g用于检查皮肤真菌，深层皮屑（刮至皮肤轻微出血）可用于检查疥螨。 6.2.5 脑 、脊髓样品 DB 5304/T 059 —2023 4 较小动物，取整个头部，无菌纱布包裹并密封待用；较大 动物，采取开颅无菌取样、用采样勺从延 脑腹侧插入枕骨大孔取样（疯牛病和羊痒病样品）、用内径 0.5cm塑料吸管插入枕骨大孔取样（犬脑组 织样品）等方法，脑、脊髓样品采集不少于 10g，浸入30%甘油盐水缓冲液 （见附录C.2）保存。 6.2.6 骨、骨髓样品 —— 骨： 将附着的肌肉和韧带等全部除去， 表面撤上食盐， 然后用浸过 5%石炭酸溶液的纱布包裹， 装入不渗漏的容器送检。 —— 骨髓：选择胸骨、肋骨、髁骨、胫骨和股骨等造血功能活跃的骨组织。大动物的骨髓采集用 活体穿刺取骨髓的方法；小动物骨头小难穿刺，只能剖杀后采胸骨、股骨等的骨髓。骨髓样 品不少于5g。 体液样品 6.3 6.3.1 脑脊液样品 6.3.1.1 颈椎穿刺法 采样前， 常规消毒术部和用具， 使用特制的专用穿刺针， 穿刺点为环枢孔。 将动物站立或横卧保定， 使其头部向前下方屈曲，穿刺针与皮肤面呈垂直缓慢刺入。将针体刺入蛛网膜下腔，立即拔出针芯，脑 脊髓液自动流出或点滴状流出，盛入消毒容器内。大型动物颈部穿刺一次采集量约 35mL～70mL。 6.3.1.2 腰椎穿刺法 穿刺部位为腰荐孔。 动物站立保定， 术部剪毛消毒后， 用专用的穿刺针刺入， 当刺入蛛网膜下腔时， 即有脑脊髓液滴状滴出或用消毒注射器抽取，盛入消毒容器内。大型动物腰椎穿刺一次采集量约 1mL～ 30mL。 6.3.2 牛、羊 O-P 液（食道 -咽部分泌物） 被检动物在采样前禁食 （可饮水） 12h， 采样探杯在使用前经 0.2％柠檬酸或 2％氢氧化钠浸泡 5min， 再用自来水冲洗，每采完一头动物，探杯要进行消毒和清洗。采样时动物站立保定，将探杯随吞咽动作 送入食道上部 10cm～15cm处，轻轻来回移动 2次～3次，然后将探杯拉出。如采集的 O-P液被反刍内容物 严重污染，用生理盐水或自来水冲洗口腔后重新采样。采集 8mL～10mL O-P液，倒入含有 等渗磷酸盐缓 冲液（见附录C.4）的灭菌容器中，加盖密封后充分摇匀，标记后放入冷藏箱及 时送检，若不能及时送 检应置-60℃冰箱冷冻保存。 6.3.3 精液 精液样品最好用假阴道挤压阴茎或人工刺激的方法采集。精液样品精子含量要多，不加防腐剂，而 且要避免抗菌冲洗剂污染。 6.3.4 乳汁 先用消毒水清洗和消毒乳房、乳头及采样者的手，然后将最初挤出的 3～4把乳汁弃去，再采集适量 乳汁于灭菌容器内，加塞密封，编号后冷藏运送。进行血清学检验的乳汁避免冻结、加热或强烈震动。 6.3.5 胆汁、脓、粘液、关节液等 对采样部位消毒后，用采血器插入吸取内部液体放入容器中备用，也可以将病料直接接种到培养基 或涂到载玻片上备镜检。 DB 5304/T 059 —2023 5 6.3.6 生殖道