ICS 11.220 CCS B 41 5304 玉溪市 地方标准 DB 5304/T 060—2023 主要动物疫病免疫抗体监测技术规范 2023 - 04 - 20发布 2023 - 07 - 19实施 玉溪市市场监督管理局 发布 DB 5304/T 060 —2023 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由玉溪市动物疫病预防控制中心提出。 本文件由玉溪市农业农村局归口。 本文件的附录A、B、C、D、E为资料性附录。 本文件起草单位：玉溪市动物疫病预防控制中心 本文件主要起草人：吕嵘、杨耀兰、罗晓燕、杨秋楠、宋诗雅、李晶、张晓舟、徐聪、荚洪涛、吴 明伟、杨曦。 DB 5304/T 060 —2023 1 主要动物疫病免疫抗体监测技术规范 1 范围 本文件规定了动物疫病免疫抗体监测的主要监测病种、血清样品采集、采样单填写、血清分离与保 存、样品的送检与接收、抗体监测方法及结果判定、监测结果记录与汇总、血清留样、无害化处理等。 本文件适用于玉溪市主要动物疫病免疫抗体监测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 18090 猪繁殖与呼吸综合征诊断方法 GB/T 18935 口蹄疫诊断技术 GB/T 27982 小反刍兽疫诊断技术 GB/T 35906 猪瘟抗体间接 ELISA检测方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 动物疫病 主要是指生物性病原引起的动物群发性疾病，包括动物传染病、寄生虫病。 3.2 抗体 在病原刺激下产生的一类能与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白，抗体主要存在于体液中。 3.3 免疫监测 普检或抽检动物群体的抗体水平，以监控群体的免疫状态，为实施计划免疫和增强免疫提供依据。 3.4 血清 血浆去除纤维蛋白原后的 (胶体性)液体。 4 主要监测病种 DB 5304/T 060 —2023 2 在玉溪市范围内开展的主要动物疫病监测病种。 —— 国家强制免疫病种：高致病性禽流感、口蹄疫、小反刍兽疫。 —— 地方计划免疫病种：新城疫、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征。 5 血清样品采集 采血器材 5.1 防护服、防护口罩、无粉乳胶手套、注射器、针头、普通真空采血管、 2ml离心管、碘酊、 75%酒精 棉球、冰袋、冷藏容器、采样登记表、记号笔、签字笔等。 采血时间 5.2 猪免疫注射 28天后（口蹄疫免疫 35天后），其他动物免疫 21天后方可采血。 采血方法 5.3 对采血部位的皮肤先剃（拔）毛，碘酊消毒， 75%的酒精脱碘。生猪采用站立式或仰卧式前腔静脉 采血、牛羊站立式颈静脉或尾静脉采血、禽类翅静脉采血。 6 采样单填写 采血时应按《血清样品采样登记表》（参见附录 A）的内容详细填写采样单，采样单一式两份，一 份由被采样单位保存，一份由采样单位保存。 7 血清的分离与保存 血清分离 7.1 采集的血液样品可室温放置析出血清，或经 4000r/min 、3-5分钟离心，吸出上层血清，放置于合适 的离心管中。 血清编号 7.2 血清编号为“行政区域拼音大写字母”加上“不同动物种类血清编号英文字母和阿拉伯数字组合” 用防水记号笔清晰标记于离心管。 —— 猪以“A01、A02、A03„„An”模式编写； —— 牛以“B01、B02、B03„„Bn”模式编写 ; —— 羊以“C01、C02、C03„„Cn”模式编写； —— 禽以“D01、D02、D03„„Dn”模式编写。 例如：红塔区猪血清编号为： HT A01;通海县禽血清编号为： TH D01。 血清的保存 7.3 血清立即检测放置 4℃保存；如果保存时间较长，应放置在 -20℃冰箱内保存。 8 样品的送检与接收 DB 5304/T 060 —2023 3 运输血清样品 时将血清放在盛有冰块的冷藏箱中运送。样品送检前送检单位填写《实验室样品送样 表》（参见附录表 B.1）；样品送达兽医实验室，实验室人员进行接收样品登记，填写《实验室接样登 记表》（参见附录表 B.2）。 9 抗体监测方法及结果判定 高致病性禽流感 9.1 9.1.1 免疫抗体监测方法： 血凝和血凝抑制试验（ HA-HI） 9.1.1.1 1%鸡红细胞制备 分别至少采集三只无特定病原体 （ SPF） 健康公鸡或未免疫 （禽流感和新城疫） 健康公鸡全血 3~5ml， 置于盛有 30~40ml灭菌生理盐水离心管中，洗涤离心 2次，每次均以 2000r/min 离心 5min，洗涤后 弃去 上清，混合于一个离心管中，以 2000r/min 离心 5min。吸取底层红细胞用灭菌生理盐水配置 1%体积的 红细胞悬液。 9.1.1.2 血凝试验（ HA） a) 在96孔V型微量反应板中，每孔加 25μL灭菌生理盐水。 b) 在微量反应板第 1孔加25μL标准阳性抗原，充分混匀。 c) 依次从第 1孔吸取25μL液体加入第 2孔，混匀后吸取 25μL加入第3孔，如此对倍稀释至 第11孔，从第 11孔吸取25μL弃去。 d) 第12孔加入25μL灭菌生理盐水为对照孔。 e) 每孔再分别加 25μL灭菌生理盐水和 25μL 1%鸡红细胞悬液。震荡混匀，室温（ 20℃~25℃） 静置 30min，对照孔红细胞呈纽扣状沉入板底，进行结果判定。 f) 结果判定：将反应板倾斜 60°，观察红细胞有无泪珠状流淌，完全无泪珠样流淌（ 100%凝集） 的最高稀释倍数判为血凝效价。 9.1.1.3 血凝抑制试验（ HI） 9.1.1.3.1 4个血凝单位病毒抗原的配置 根据HA试验测定的效价配制 4个血凝单位（即 4HAU）的病毒抗原。例：以血凝试验血凝效价（凝集 终点）为 10log2或210（1：1024）为例， 4HAU为1024/4=256 （1：256），在255份生理盐水里加入 1份抗 原。 9.1.1.3.2 抗原回测检查 血凝抑制试验前应对 4HAU抗原进行回测，调整准确。选取 96孔V型板5个孔，在 2~5孔每孔加入 25μ L灭菌生理盐水，将配制好的 4HAU抗原25μL加入第1~2孔，从第 2孔开始按 1：1、1：2、1：4、1：8、1： 16倍比稀释，即依次形成 4HAU、2HAU、1HAU、1/2HAU、1/4HAU抗原浓度；再分别加入灭菌生理盐水 25 μL和1%鸡红细胞悬液 25μL。震荡混匀，室温（ 20℃~25℃）静置 30min，观察结果。若配置的 4HAU抗 原液准确 ,则1：4稀释度将出现凝集终点；如高于 4HAU,凝集终点将后移，在已配 制好的4HAU抗原液中添 加等量的灭菌生理盐水，二次回测；如低于 4HAU,凝集终点将前移，在已配制好的 4HAU病毒抗原液中添 加等量的抗原，二次回测。 DB 5304/T 060 —2023 4 9.1.1.3.3 血清抗体效价测定 a) 在微量反应板的第 1孔~第11孔加入25μL灭菌生理盐水，第 12孔加入50μL灭菌生理盐水 作为空白对照。 b) 吸取25μL血清加入第 1孔内，充分混匀后，吸取 25μL加入到第 2孔，依次对倍稀释至第 10孔，从第 10孔吸取25μL弃去。第 11孔为抗原对照。 c) 1孔~11孔均加入 25μL 4HAU抗原，在室温（ 20℃~25℃）静置 30min。 d) 每孔加入 25μL 1%鸡红细胞悬液，震荡混匀，室温（ 20℃~25℃）静置 30min，待对照孔（ 12 孔）红细胞呈纽扣状沉入孔底时判定结果。 e) 当抗原对照孔（第 11孔）完全凝集，且阴性对照血清抗体效价不高于 2log2或22（1：4）， 阳性对照血清抗体效价与已知效价误差不超过 1个滴度时，试验方可成立。以完全抑制 4HAU 病毒抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的 HI抗体效价。 9.1.2 结果判定 血清HI抗体效价≤ 3log2或23判为HI试验阴性； HI效价≥4log2或24判为HI试验阳性。 口蹄疫 9.2 9.2.1 免疫抗体监测方法 酶联免疫吸附试验（ ELISA） 9.2.1.1 液相阻断 ELISA 液相阻断 ELISA试验方法按照 GB/T 18935 执行； 9.2.1.2 竞争ELISA 采用商品试剂盒进行检测，按其说明书进行操作。 9.2.2 结果判定 —— 液相阻断 ELISA：按照GB/T 18935 执行； —— 商品化ELISA试剂盒按其说明书进行判定。 小反刍兽疫 9.3 9.3.1 免疫抗体监测方法 竞争ELISA试验方法按照 GB/T 27982 执行； 采用商品化 ELISA试剂盒进行检测， 按其说明书进行操作。 9.3.2 结果判定 —— 竞争ELISA：按照GB/T 27982 执行； —— 商品化ELISA试剂盒按其说明书进行判定。 新城疫 9.4 9.4.1