DB64 宁夏回族自治区地方标准 DB 64/ T1517--2017 实时荧光PCR法 Identification of fox derived materials in meat and meat products 地方标准信息服务平台 Rdal-time PCR method 2017-11-22 发布 2018-02-22实施 宁夏回族自治区质量技术监督局 发布 地方标准信息服务平台 DB64/T1517-2017 言 本标准编写格式符合GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求。 本标准由宁夏回族自治区食品药品监督管理局归口。 本标准由宁夏回族自治区食品检测中心起草。 本标准主要起草人：岳苑、贾冰凝、何微、吴明、张慧玲、高俊峰。 地方标准信息服务平台 地方标准信息服务平台 DB64/T1517--2017 肉及肉制品中狐狸源性成分定性检测方法 实时荧光PCR法 ¥1范围 本标准规定了肉及肉制品中狐狸源性成分实时荧光PCR检测方法。 本标准适用于肉及肉制品中狐狸源性成分的定性检测。 该检测方法的检出限为0.1%。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27025检测和校准实验室能力的通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义、缩略语 下列术语和定义、缩略语适用于本标准。 3.1术语和定义 3.1.1 狐狸源性成分fox-derivedmaterials 狐狸种属特异性DNA片段。 3.1.2 准信息服务平台 实时荧光 PCR real-time fluorescent PCR 实时荧光聚合酶链式反应。 3.1.3 Ct 值Cycle threshold Ct 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 3.1.4 内参照InternalControl 在真核生物16sRNA的保守区域设计了内参照上下游引物和探针，探针的5'端标记羧基荧光素（FAM）， 3'端标记荧光淬灭剂（TAMRA）。用于监控PCR反应是否正常进行以及防止假阴性结果的出现。 1 DB64/T1517—2017 缩略语： DNA deoxyribonuleic acid 脱氧核糖核酸。 PCR polymerise chain reaction 聚合酶链式反应。 Taq Thermus aquaticu 水生栖热菌。 FAM 6-carboxyfluorescein 6-羧基荧光素。 TAMRA 6-CarboxytetramethyIrhodamine 6-羧基四甲基罗丹明。 4原理 本标准采用实时荧光PCR技术，根据线粒体DNA上动物种间多态性的差异而进行动物源性种类鉴定。 通过标记荧光物质（FAM)的特异性探针进行特异性扩增，观察实时荧光PCR的增幅曲线，从而对肉制品中 狐狸源性成分进行检测。 5仪器设备 5.1 实时荧光PCR检测系统。 5.2高速冷冻离心机（转速12000r/min以上）。 5.3核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 5.4 冰箱(2℃～8℃和-20℃~-80℃)。 5.5微量可调移液器：0.5μL～10μL，10uL～100μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。 准信息服务平台 5.6 恒温加热器（4℃100℃）。 5.7 可移动紫外灯。 5.8分析天平：感量为0.1mg。 5.9高压灭菌锅。 5.10 干热灭菌器。 5.11振荡器。 6材料及试剂 6.1材料 6.1.1实时荧光PCR反应管。 6.1.2微量可调移液器配置吸头：10uL，200μL，1000μL。 2 DB64/T1517—2017 6.1.3离心管。 6.2试剂 除特别说明以外，所用试剂均为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水。所有试剂 均用无DNA酶污染的容器分装。试剂的选购、验收、储存应符合GB/T27025的规定。 6.2.1基因组DNA提取试剂盒1：提取步骤及使用注意事项参见附录A。 6.2.2 荧光定量PCR反应预混液1’：使用方法及使用注意事项参见附录B。 6.2.3引物及探针 6.2.3.1 内参照 引物： 5'-gttcgtttgttcaacgattaa-3" 5'-agatagaaaccgacctggat-3" 探针： FAM-ctccggtctgaactcagatcacgta-TAMRA 6.2.3.2 狐狸源性成分 引物： 5'-tggagcatcagtagaccttacaattt-3' 5'-ggcgggaggttttatattgataatag-3" 探针： FAM-ccctgcacctggccggagtc-TAMRA 7抽样 7.1采样工具 采样工具剪刀、镊子应经干热灭菌器180℃士20℃，2h高温灭菌。 7.2样品采集及储运 样品采集后，将采集的样品放人无菌采样袋（一个采样点的样品放人一个塑料袋)或其他灭菌容器， 编号，于保温箱中加冰、密封，送实验室， 准信息服务平 8操作方法 8.1样品模板DNA的制备 在样本制备区进行。提取步骤及使用注意事项参见附录A 8.2DNA定量 将DNA溶液做适当稀释，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值。 10D260mm=50μg/mL双链DNA或38μg/mL单链DNA。DNA的浓度按照式（1）计算，当OD260/OD280比值在1.5～2.1 之间时，适宜于PCR扩增。扩增前将所有样品DNA稀释至10ng/μL～50ng/μuL。 1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如其他等效产品具有相同的效果，则可 使用这些等效产品。 3