ICS 65.020 B 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T28660—2012 马铃薯种薯真实性和纯度鉴定 SSR分子标记 Genuineness and purity verification of potato seed-tuber- SSR molecular marker 2012-09-03发布 2012-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T28660—2012 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国农作物种子标准化技术委员会（SAC/TC37)归口。 本标准起草单位：云南师范大学薯类作物研究所、中国农科院蔬菜花卉研究所、东北农业大学农学 马铃薯中心(CIP)北京联络处。 本标准主要起草人：李灿辉、郝大海、金黎平、杨仕忠、管朝旭、黄三文、陈伊里、谢从华、白艳菊、 谢开云。 I GB/T 28660—2012 马铃薯种薯真实性和纯度鉴定 SSR分子标记 1范围 本标准规定了SSR分子标记鉴定马铃薯（SolanumtuberosumL.）品种的方法。 本标准适用于马铃薯种薯真实性和纯度的检测。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB18133马铃薯脱毒种薯 SZIC 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 简单序列重复 simple sequence repeat;SSR 3.2 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction;PCR 在耐热DNA聚合酶作用下，于体外快速大量特异性扩增特定DNA序列的方法。 4 仪器和试剂 4. 1 仪器及用具 4. 1. 1 梯度PCR仪。 4. 1. 2 低温高速离心机。 4.1.3 电泳仪（满足3000V稳压）及配套电泳槽。 4.1.4 凝胶成像分析系统。 4. 1.5 冰箱(-28℃~4℃)。 4. 1. 6 紫外/可见分光光度计。 4.1.7 电热恒温水浴锅（37℃、42℃、65℃和95℃）。 4. 1. 8 制冰机。 4. 1. 9 涡旋仪。 4. 1. 10 高压灭菌器。 4. 1. 11 液氮罐。 4. 1. 12 酸度计（pH计）。 4. 1. 13 脱色摇床。 1 GB/T28660—2012 4. 1. 14 4.1. 15 4.2试剂 4.2.1常用贮备液：见附录A。 4.2.2DNA提取试剂:见附录B 4.2.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂：见附录C。 4.2.4 银染试剂：见附录D。 4.2.5 SSR（简单重复序列）标记引物：见附录E。 4.2. 6 TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)和配套的PCR缓冲液。 4.2.7 DNAMarker(50bp、100bp.150bp、200bp、250bp.300bp、350bp、400bp.500bp)。 4.2.8 无DNA酶的RNA酶A(DNase-freeRNaseA,10mg/mL)。 4.2. 9 β-巯基乙醇。 四甲基二乙胺（TEMED)。 4.2. 10 4. 2. 11 异丙醇。 4.2.12 乙醇（70%、90%、95%)。 4.2.13 灭菌双蒸水（ddH2O）。 5供试材料 5.1取样 按照GB18133要求的方法，采集大田植株或块茎作为检测样品。 5.2样品保存 选取适量样品，装人冻存管，液氮速冻，置冰箱（一20℃以下）中保存备用（有效保存期约6个月）。 6程序 6.1总DNA提取 6.1.1称取100mg样品，置于预冷1.5mL离心管中，液氮冷冻下迅速研磨成细粉。依次加入700ul 的两倍十六烷基三甲基溴化铵缓冲液（见表B.1)和2μL的β-硫基乙醇，涡旋混匀。 6.1.2置65℃水浴1h.期间每隔10min摇动混勺一次。 6.1.3冰上冷却约10min后，加人700μL的三氯甲烷：异戊醇（24：1）混合液（见表B.2），涡旋混 合，轻缓颠倒混匀数次。12000r/min离心5min。 6.1.4吸取上层水相至新1.5mL离心管中，加入等体积（400uL～500L）的预冷异内醇。轻缓颠 倒混匀，4℃冰箱静置30min后，12000r/min离心15min。 6.1.5弃上清液。向离心管中加人70%乙醇1.0mL，静置3min后，12000r/min离心20min。小心 倒出70%乙醇，再加入90%乙醇1.0mL，静置5min后，12000r/min离心10min，小心倒去乙醇。在 干净的吸水纸上倒置离心管，自然干燥15min。晾干的DNA，应为透明状。 6.1.6加人100μL的1×TE缓冲液[将10倍三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液（见表B.3）稀 释10倍并灭菌溶解DNA，再加入2μL的无DNA酶的RNA酶A（10mg/mL）。37℃温浴1h去除 RNA。4℃冰箱放置备用。 6.1.7取DNA提取液1μL～5μL于新的1.5mL离心管中,加人1×TE缓冲液稀释至1.0mL,混 2 GB/T 28660—2012 匀后转入石英比色皿中，用紫外/可见分光光度计测定OD26和OD280下的光密度值。按式（1）计算提取 液中DNA浓度，并检测质量（OD260/OD280比值为1.81.9表明纯度较高）。 OD260XtX 50 ds DNA - ........(1) 1000 式中： dsDNA 双链DNA分子的含量，单位为微克每毫升（μg/mL）； OD260 260nm下的光密度值； 稀释倍数。 6. 1. 8 用1×TE缓冲液将所提取的总DNA稀释为50ng/μL，根据每次用量分装，置一20℃冰箱保存 备用。 6.2 PCR反应 6.2. 1 PCR反应体系 在冰盘中或4℃条件下按表1所列成分和用量，顺序依次加人PCR管，准备PCR反应体系。 表1 PCR反应体系（供1个样品、1对SSR引物检测，25μL) 用量/μL 成 分 O"HPP 16. 1 10×PCR缓冲液 2. 5 dNTPs（2.5mmol/L,每一种） 2.0 正向引物（10mmol/L） 1. 0 反向引物（10mmol/L） 1. 0 0.4 TaqDNA聚合酶（2.5U/μL) DNA模板（50ng/μL) 2.0 总体积 25.0 6.2.2 反应程序 按表2程序设置PCR反应流程。 表 2 PCR反应程序 反应程序 时间 备注 94℃预变性 5 min 94℃变性 1 min 55℃退火 1 min 不同SSR引物所需的退火温度见附录E 72℃延伸 1 min 循环次数 35次 变性→退火→延伸反应循环次数 72℃延伸 5min 4℃终止反应 3