ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 28082—2011 榆枯萎病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Ophiostoma novo-ulmi Brasier and Ophiostoma ulmi(Buisman) Nannf. 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 28082—2011 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院 本标准主要起草人：吴品珊、严进、杜洪忠 GB/T 28082—2011 榆枯萎病菌检疫鉴定方法 1范围 SZIC 本标准规定了榆枯萎病菌的分离培养、形态学鉴定的方法 本标准适用于来自榆枯菱病菌有发生国家和地区的榆属（UlmusL.）苗木、原木、木制品和木包装 中榆枯萎病菌的检疫鉴定。 榆枯萎病菌基本信息 2 中文名：榆枯萎病菌。 学名：Ophiostoma novo-ulmiBrasier; Ophiostoma ulmi(Buisman)Nannf. 异名:Ceratocystis ulmi(Buism.)Moreau。 病害英文名：dutchelmdisease,elmwiltdisease。 属真菌界Fungi子囊菌门Ascomycota，子囊菌纲Ascomycetes，粪科菌亚纲Sordariomycetidae，长 喙壳目Ophiostomatales，长喙壳科Ophiostomataceae，长喙壳属Ophiostoma。 榆枯萎病菌其他信息参见附录A。 3 方法原理 4仪器 4.1生物显微镜。 4. 2 体视显微镜。 4.3 3光照生物培养箱。 4.4高压灭菌器。 4. 5 超净工作台。 4. 6 电子天平。 摇床。 4.7 5 试剂和培养基 5.1试剂 琼脂粉，麦芽膏，Oxoid麦芽提取物，榆树枝条，葡萄糖，天门冬酰胺（L-asparagine），磷酸二氢钾 （KH,PO），硫酸镁（MgSO4：7H,O），硫酸锌（ZnSO），三氯化铁（FeCl），维生素B，维生素B，放线 菌酮，链霉素，青霉素。 注：放线菌酮为剧毒品，注意防护。 1 GB/T28082—2011 5.2培养基 5.2.1选择性培养基 0.2g放线菌酮溶于100mL水，取50mL加于1000mL麦芽膏（MA）培养基内，灭菌后冷至45℃， 加入10mL含1%链霉素和1%青霉素的混合液。 5.2.2麦芽膏培养基 MA 25g麦芽膏，17g琼脂粉，1000mL蒸馏水，灭菌。 5.2.3榆边材培养基ESA 取50g健康的榆树边材或枝条，去皮粉碎成直径0.5cm的小块，15g琼脂粉，500mL蒸馏水， 灭菌。 5.2.4Tchernoff改良培养液 20g葡萄糖、2g天门冬酰胺、1.5g磷酸二氢钾、1g硫酸镁、20mg硫酸锌、10mg三氯化铁、1mg 维生素B和1mg维生素B，1000mL蒸馏水，灭菌。 5.2.5Oxoid麦芽提取物培养基MEA 33gOxoid麦芽提取物，10g琼脂粉，1000mL蒸馏水，灭菌。 6标准菌株 Ophiostomanovo-ulmiA交配型（Amatingtype)，雌性;B交配型（Bmatingtype),雄性。 OphiostomaulmiA交配型（Amating type),雌性;B交配型(Bmatingtype),雄性。 中国检验检疫科学院保存病菌的标准菌株。 7检测 检查苗木、原木或木材的表面，纵向和横向切开树干或枝条检查。 榆枯萎病菌的2个种引起的外观症状是相同的。在树干或枝条的横切面上，可见靠近外面的年轮 附近有深褐色斑点或条纹，有时斑点密集，可连成断续的深褐色圆环。去掉树皮，木质部上有深褐色纵 向条纹，有时条纹不明显，可轻削一层木质，条纹便显现出来。切开枝权处，常可找到小露的蛀食槽。 取有如下症状的样品做病菌分离：干枯呈深褐色的枝条，有小蠹蛀食槽痕迹的树皮，横断面上有深 褐色斑点或断续的褐色圆环枝干，纵切面有褐色条纹枝干，货物上附着有小虫。 8鉴定 8.1分离培养 对变色的木质部，去掉树皮，切取直径为5mm大小，于选择性培养基（见5.2.1）上，20℃黑暗培 养；对有虫蛀槽的树皮，清除蛀槽内的虫粪和残屑，70%酒精消毒10s～30s，无菌水冲洗，灭菌滤纸吸干 水分，切取边长为5mm~10mm的大小，于选择性培养基上，20℃黑暗培养；小虫解肢为5mm大 小，70%酒精消毒10s～30S，无菌水冲洗，灭菌滤纸吸干水分，于选择性培养基上，20℃黑暗培养。一 2 GB/T28082—2011 日有真菌菌落出现，立即分别转皿。 转皿到ESA培养基，2o℃培养，以期获得粘束梗霉Pesotumulmi；转接于Tchernoff改良培养液 中，室温下110r/min振荡培养，以期获得酵母状分生孢子Blastomyces；转皿到MEA培养基，20℃黑 暗培养，以做种的鉴定。 8.2子囊孢子培育 子囊孢子需在A、B型2种交配型同时存在的ESA培养基上形成。如确认在ESA培养基上长出 褐色粘束梗霉，同时取Ophiostomanovo-ulmi（任意亚种）和Ophiostomaulmi标准菌株的A，B交配 型，分别与分离出的病菌，等距离三角形接种在ESA培养基上，各重复3皿，20℃黑暗培养7d，然后室 温（20℃～25℃）漫射光下继续培养14d。 8.3种的鉴定 菌落形态、菌落生长速度和最佳生长温度，是区分榆枯萎病菌两个种的主要指标。 取在MEA培养基上培养的新鲜菌块（2mm大小），转接在MEA培养基中央，共转6皿，3皿置于 20℃黑暗培养，3血皿置于33℃黑暗培养 续培养10d，以观察菌落特征。 E，按（E一E，）/8计算待测菌8d的平均辐射状生长速度（mm/d）。最后将培养皿置于室温，漫射光继 续培养10d，以观察菌落特征。 必要时做亚种鉴定（参见附录B）。 9结果判定 9.1Ophiostoma novo-ulmi 9.1.1菌落特征 在MEA培养基上，经20℃黑暗7d和室温漫射光10d培养后，菌落灰白至乳白色，花瓣状，轮纹明 显。气生菌丝量中等，常结集成绳索状使菌落有条纹呈现。欧亚亚种O.novo-ulmisubsp.novo-ulmi 的菌落条纹较少，边缘有不规则的叶状浅裂。 O.novo-ulmi在20℃黑暗条件下生长较快。生长速度为（2.8mm/d~）3.1mm/d~4.8mm/d（~ 5.7mm/d),33℃的生长速度为（0mm/d~)0.1mm/d~0.5mm/d。 9.1.2病菌形态 菌丝：分隔，直径1μm6μm，气生菌丝常结集成绳索状，菌丝体分生孢子丰富。 粘束梗霉Pesotumulmi：易在ESA培养基上形成。束丝无性态（synnematalanamorph）单个或多 个，褐色到黑色，纤细，1mm～2mm长；褐色假根状菌丝附着在培养基上，褐色有隔菌丝平行构成束状， 顶部张开分枝成透明的菌丝，其上产生分生孢子。分生孢子全壁芽殖、单胞、透明、卵形到椭圆形、大小 发簇孢Sporothrir：可在大多数培养基上形成。分生孢子梗多侧生，10μm～30μm（～50um），分 生孢子（4.5μm~14μm）×（2μm~3μm），全壁芽生，有0.5μm~1μm的细齿，单胞、透明，椭圆形至长 形，尖端通常较细、微弯，连有一个小囊领。菌丝体分生孢子常聚成粘性滴状，酵母状芽殖。 3