ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 28064—2011 蚕豆染色病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of broad bean stain virus 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 28064—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共 和国深圳出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：陈红运、陈青、林石明、郑耘、赵文军、李一农、廖富荣、余芳平、朱水芳、陈枝楠。 I GB/T 28064—2011 蚕豆染色病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了蚕豆染色病毒的血清学和分子检测方法。 本标准适用于蚕豆Viciafaba、小扁豆Lensculinaris、豌豆Pisumsativum和菜豆Phaseolus uulgaris种子携带蚕豆染色病毒的检疫鉴定。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 蚕豆染色病毒基本信息 3 中文名：蚕豆染色病毒。 学名:broad bean stain virus。 缩写：BBSV。 属豇豆花叶病毒科Comoviridae；豇豆花叶病毒属Comovirus。 病株花粉可通过授粉将病毒传至健株种子：远距离通过种子传播，种传寄主有蚕豆（种传率4%~ 16%）、豌豆（20%）和小扁豆（0.2%~32.4%）。BBSV易机械接种传播，并可通过甲虫传毒，豆长喙象 甲Apionvoraa是最主要的传毒介体。 蚕豆染色病毒的其他信息参见附录A。 4方法原理 主要根据BBSV的血清学特性和基因组特征进行鉴定，生物学测定为辅助鉴定手段。 5仪器、设施及试剂 5.1仪器与设施 酶联检测仪、电子天平（感量0.O001g）、定性PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、恒温水浴、低 温冰箱、普通冰箱、离心机等；微量移液器（2.5μL，10μL，20μL，100μL，200μL,1000μL）；酶联板、研 钵等；防虫温室。 5.2试剂 酶联免疫吸附测定试剂（见附录B)、RT-PCR检测试剂（见附录C)。 1 GB/T28064—2011 6检测与鉴定 6.1抽样 按照SN/T2122的规定执行。 6.2制样 选取种皮呈BBSV为害症状的可疑病粒，无可疑病粒时随机选取。用无菌水浸种16h，磁盘中放 入两层吸满水的滤纸，将充分吸水的种子摆放在滤纸上，20℃催芽，芽长2cm4cm时取芽进行检测。 检测方法见6.3。 注：资源性引种时，每份资源选10粒～14粒种子播种于防虫温室或网室内，待长出4片～6片叶时挑选有病毒症 状植株的叶片进行检测。 6.3检测 6.3.1酶联免疫吸附测定 双抗体夹心法见附录B。 6.3. 2 RT-PCR检测 称取0.1g植物组织提取总RNA，沉淀充分干燥后溶于30μLDEPC处理的去离子水中。 RT-PCR检测方法见附录C。 6.3.3生物学测定 生物学测定参见附录D。 7结果判定与记录 7.1结果判定 SZIG 酶联测定为阳性后,RT-PCR检测结果呈阴性或者鉴别寄主反应与附录D描述不符合，判定未检 出蚕豆染色病毒。 酶联测定为阳性后,RT-PCR检测结果呈阳性或者鉴别寄主反应与附录D描述相符合，判定检出 蚕豆染色病毒。 直接对样品进行RT-PCR检测时，检测结果呈阳性即可判定检出蚕豆染色病毒。 7.2结果记录 记录包括：样品来源、种类、取样人员、原始记录和检测结果等。酶联测定应有酶联板反应的原始数 据，RT-PCR检测应有电泳结果图片，生物学测定应有鉴别寄主的症状照片。 8 样品保存 经检验确定携带蚕豆染色病毒的样品应在合适的条件下保存，种子保存在4℃，病株在一20℃或 者一80℃冰箱中保存，做好标记和登记工作。 2 GB/T28064—2011 附录A （资料性附录） 蚕豆染色病毒寄主、分布及危害症状 A.1寄主范围 BBSV侵染7种豆科植物：美丽猪屎豆（Crotalariaspectabilis）、毛羽扇豆（Lupinushirsutus）、白花 草木犀（Melilotusalba）、菜豆、豌豆、绛车轴草（Trifoliumincarnatum）和蚕豆。 A.2病害症状 A.2.1蚕豆 蚕豆感染BBSV后，症状分为花叶型和坏死型。花叶型表现为接种叶片上有或无局部斑，新叶均 呈褪绿条纹状、环状和块状花叶片上出现褪绿斑驳和花叶症状；坏死型表现为接种叶片有或无黄化或局 部斑，叶脉和茎出现坏死条纹，最后茎坏死、顶枯、全株萎焉。种子表皮出现褐色坏死色斑。 A.2.2豌豆 豌豆感染BBSV后，症状分为花叶型、顶枯型和花叶、顶枯混合型。花叶型先在新叶出现系统褪绿 点，后发展为花叶、畸形；顶枯型在茎上出现系统褐色或坏死条纹，后顶梢枯死。 A.2.3菜豆 豌豆感染BBSV后，症状分为局部斑和系统斑。局部斑是在接种叶上产生局部坏死斑或先为局部 A.2.4小扁豆 小扁豆感染BBSV后，症状不明显或很长时间才有症状反应，有些品种出现死株，有些品种接种后 25d才见新叶上出现不明显花叶。因此小扁豆不适合作繁殖寄主或鉴别寄主。 A.3分布地区 英国、法国、德国、瑞典、捷克、奥地利、波兰、匈牙利、意大利、叙利亚、黎巴嫩、苏丹、摩洛哥、埃及和 突尼斯等欧洲、西亚和北非国家。 3