ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 27644—2011 禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法 Protocol of real-time PCR for detecting Gallid Hepers Virus 2 2011-12-30发布 2012-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27644—2011 前言 本标准按照GB/T1.1—2009的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、扬州大学、河南农业大学 本标准主要起草人：詹爱军、刘文博、王新卫、卢体康、花群义、陈书琨、秦智锋、陈兵、高小博。 I GB/T27644—2011 禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了禽疱疹病毒2型荧光PCR检测的操作方法。 本标准适用于禽疱疹病毒2型的鉴定及其流行病学调查、诊断、检疫和监测 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。 DNA：deoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸。 dNTP:deoxy-ribonucleoside triphosphate 三磷酸脱氧核糖核苷。含有dCTP、dGTP、dATP、 dTTP四种脱氧核糖核苷。 EDTA：ethylenediaminetetraacetic acid乙二胺四乙酸。 GHV2:GallidHepersVirus2禽疱疹病毒2型（马立克氏病病毒血清1型）。 MD：Marek'sDisease马立克氏病。 PBS:phosphatebelanced solution磷酸盐缓冲生理盐水。 PCR:polymerase chain reaction聚合酶链式反应。 Real-time PCR:Real-time polymerase chain reaction 实时荧光聚合酶链反应。 Taq酶：Thermus aquaticus polymerase耐热DNA聚合酶。 4试剂 4.1试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682规定的二级水，所用化学试剂均为分 析纯。 4.2禽疱疹病毒2型荧光PCR检测试剂盒，一20℃保存，组成及使用注意事项参见附录A。 4.3引物和探针序列（产物长度142bp） 上游引物：5’CCACCACCTCCCATCTGTAC3’ 下游引物：5’GACAAGGCTGAGCGTAAACC3" TaqMan探针：5’ACACGGCTCGGTAACAGGACACAATG3'，其5’端和3'端分别标记FAM 和BHQ(或Tamra或Eclipse)。 4.41%肝素钠，配制方法见B.1，4℃保存。 4. 5 5三氯甲烷，常温保存。 1 GB/T27644—2011 4. 6 异丙醇，使用前预冷至一20℃。 4.7无水乙醇。 4. 8 75%乙醇，采用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，使用前预冷至一20℃。 4. 9 0.01mol/LPBS，pH7.2，配制方法见B.2。 5器材和设备 5. 1 无菌注射器，1mL,5mL,10mL,25mL，100mL。 5.2 一次性无菌塑料袋。 5. 3 1.5mL无DNA酶和RNA酶的Eppendorf管。 5.40.2mL无DNA酶和RNA酶的PCR薄壁管、八联管或96孔板。 5.5荧光PCR检测仪。 5. 6 高速台式冷冻离心机，可控温至4℃、离心速度可达12000g以上。 5.7振荡器。 5.8研钵。 5.9普通冰箱和超低温冰箱：规格2℃~8℃，-20℃，一80℃。 5.10 微量移液器，0μ~2μL，1μL~10μL，10μL~100μL，20μL~200μL，100μL~1000μL，并配 备与移液器匹配的无DNA酶和RNA酶的吸头。 6样品的采集和处理 6.1样品的采集 6.1.1 全血 6.1.2羽毛和组织脏器 取待检羽毛（从根部挤出少量羽髓）、肝脏、肾脏和脾脏样品装人一次性塑料袋或其他灭菌容器，编 号，送实验室。 6.2样品贮运 样品采集后，放人密闭的塑料袋内（一个采样点的样品，放一个塑料袋），于保温箱中加冰、密封，送 实验室。 6.3样品处理 6.3.1全血 3000g离心15min，弃上清，编号备用。 6.3.2羽毛或组织脏器 取待检样品2.0g加人2mLpH7.2的0.01mol/LPBS于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨， 分装编号备用。 2 GB/T27644—2011 6.4样本存放 制备的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置一70℃以下，但应避免反复 冻融（冻融不超过3次），淋巴细胞样品在2℃～8℃条件下保存。 7核酸提取及荧光PCR检测 7. 1 注意事项 实验室注意事项见附录C。 7.2核酸提取 7.2.1取n个灭菌的1.5mLEppendorf管（n为被检样品之和），编号。 7.2.2每管加人250μLDNA提取液（参见附录A），然后分别加入被检样本各250μL，一份样本换用 一个吸头，再加人10μL蛋白酶K（1mg/mL），混匀器上振荡混匀，56℃消化2h，加人等体积的三氯甲 烷，混匀，15000g离心15min。 7.2.3取与7.2.1相同数量灭菌的1.5mLEppendorf管，吸取7.2.2各管中的上清液转移至相应的 管中，不能吸出中间层，然后再分别加人等体积的一20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀。 7.2.415000g离心15min，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入800μL75%乙醇，颠倒 洗涤。 7.2.515000g离心10min，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。 温干燥5min~10min。 7.2.7加人10μL灭菌双蒸水，溶解管壁上的DNA，6000g离心5s，4℃保存备用。若需长期保存须 放置一80℃冰箱。 7.3扩增检测 7.3.1扩增试剂准备 在反应混合物配制区进行 取出MDVPCR反应液（参见附录A)，在室温下融化后，1000g离心5s，每个PCR反应按表1配 制PCR反应混合液（需配制反应液数量=样本个数十阴性对照十阳性对照）： 表 1 试剂 MDVPCR反应液 bBL 用量 21.75μL 0.25 μL 将以上PCR反应试剂按使用量吸取到一个离心管中，充分混勾，然后在每个PCR管中分装22μL， 转移至样本处理区。 7.3.2加样 人荧光PCR检测仪内，记录样本放置顺序。 3