ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T27640—2011 马痘诊断技术 Diagnostic techniques for horsepox disease 2011-12-30发布 2012-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27640—2011 前言 本标准按照GB/T1.1—2009的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国动物卫生与流行病学中心。 本标准主要起草人：梁成珠、朱来华、肖西志、郑小龙、邓明俊、岳志芹、毕道荣、梁君妮、徐彪。 I GB/T27640—2011 马痘诊断技术 1范围 本标准规定了马痘临床诊断、病毒分离与鉴定等诊断技术要求 本标准适用于马痘的诊断。 2临床检查 2.1临床特征 病马于系部和球节处的皮肤上出现丘疹随后变为水疱，最后为脓疱，并干而结痴。由于局部疼 痛，可引起跛行，病马一般不显全身症状；有的病马于唇内侧、齿龈、舌、舌系带、颊部等粘膜上发生痘疹 也是先发丘疹，继而水疱和脓疱，脓疱破裂形成浅的溃疡；母畜外生殖器水肿，并在皮肤和粘膜上形成水 疱、脓疱和溃疡，公畜的病变表现为阴茎、包皮和龟头上的痘疹样病变 2. 2 初步判定 2.2.1根据临床特征可作出病马感染马痘的初步判定。 2. 2. 2 最终判定应进行病毒分离鉴定。 3病毒分离 3.1样品采集和运送要求 采取病变部位的渗出液、水疱液和溃疡部位组织作为采集对象，尽量无菌采集，采集后低温送实验 室进行病毒分离。 3.2病毒分离试验 3.2.1所需仪器、设备 3.2.1.1CO，培养箱。 3.2.1.2 Ⅱ级生物安全柜。 3倒置显微镜。 3.2.1.3 3.2. 1. 4 带冷冻功能的离心机。 3.2.2 材料准备 3.2.2.1细胞培养基DMEM。 3. 2. 2. 2 Hela细胞。 3. 2. 2.3 Hanks液（Hanks液，见A.l；含抗生素，见A.4）。 3. 2. 2. 4 小牛血清。 3.2.2.5待检马组织：采取病变部渗出液、水疱液或丘疹和溃疡部组织作为标本，用Hanks液配制成 1：10悬液，以1500r/min离心10min，取上清备用。 1 GB/T27640—2011 3.2.2.6接种方法：用含10%小牛血清的DMEM培养液培养Hela细胞，待细胞长成单层后弃去培养 液。将3.2.2.5中的待检组织接种Hela细胞，然后加入含5%小牛血清的DMEM培养液。CO，培养 箱内37℃，48h后观察细胞病变。 3.3判定 如果48h后出现明显的细胞病变，如细胞圆缩、聚集，可进一步做病毒鉴定。正常的Hela细胞为 多角形，贴壁生长。 4电子显微镜检查 4.1材料准备 4.1.1戊二醛，碳网膜，三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（Tris-EDTA），磷钨酸（pH7.2），滤纸，载 玻片。 4.1.2病毒液或待检病料，如病变部位的渗出液或水疱液。 4.2负染操作方法 4.2.1用戊二醛固定待检病料。 氨基甲烷-乙二胺四乙酸（Tris-EDTA)缓冲液中浸泡20s，然后用一滴1%的磷钨酸（pH7.2)染色10s。 取出碳网膜，用滤纸吸干膜上液体，待自然干燥后镜检。 4.3判定 电镜下见到砖形或大卵圆形，有一个双凹面的核心体，同时具有包膜。观察到上述结果，可判定为 马痘感染。 5分子生物学检测 5.1材料准备 5.1.1待检样品材料 分离的病毒、病毒感染的细胞或所采集的病料，如病变部位的渗出液或水疱液。 5.1.2仪器设备 或相关仪器（琼脂糖凝胶的制备），超声波破碎仪，一20℃冰箱。 5.1.3试剂 0.25%胰蛋白酶溶液（见A.2），RNase，70%乙醇，TaqDNA聚合酶，PBS缓冲液，酚三氯甲烷，引 物，dNTPs，去离子水，加样缓冲液，电泳缓冲液，溴化乙锭溶液（见B.3）或相关染料（现在已经有溴化乙 锭的替代产品，而且无致癌性，如GelRed）。缓冲液的配方见附录B。 5.2病毒基因组DNA的制备 用0.25%的胰酶消化感染病毒的Hela细胞，3000r/min离心5min，收集的细胞沉淀用PBS缓冲 2 GB/T27640—2011 液重悬，于95℃水浴灭活30min。重复离心，收集沉淀。再用2mLPBS缓冲液重悬细胞。将细胞至 于冰浴，超声波粉碎，输出功率为40W，时间3min，每5s暂停5s。细胞经破碎后加人10μLRNase， 37℃反应30min。待溶液温度降至室温后，加入400μL酚三氯甲烷，混匀后于冰浴中放置5min，然后 13000r/min离心5min，收集DNA沉淀。用70%乙醇洗沉淀一次。空气干燥沉淀，加人100L去离 子水溶解DNA，分装保存于一20℃冰箱中备用。本步骤也可采取相关商品化的病毒DNA提取试剂 盒。采集的病料可采取同样的方法或用商品化试剂盒进行病毒DNA的提取。 5.3痘苗病毒血细胞凝集素HAHemagglutinin，HA）基因的PCR扩增 5.3.1引物序列 上游引物:5'-ATG ACACGA TTG CCA ATAC-3'; 下游引物:5'-CTA GAC TTT GTT TTC TG-3'。 5.3.2各反应物浓度 引物25pmol/μL，dNTPs2.5mmol/μL，TaqDNA聚合酶5U/μL，反应体系为25μL。 5.3.3扩增条件 93℃5min，92℃，30s；55℃，30s；72℃，1min。共35个循环。预扩增片段大小为940bp 5.3.4电泳 40 min 5.4马痘病毒的PCR检测 5.4.1引物序列 下游引物：5-ACGCTGAAACGGAACCTGTAT-3。 5.4.2各反应物浓度 引物25pmol/μLdNTPs2.5mmol/μL，TaqDNA聚合酶5U/μL，反应体系为25μL。 5.4.3扩增条件 93℃,5min，93℃，30s，53℃,30s，72℃,30s，35个循环。预片段大小为637bp。 5.4.4电泳 制备1%琼脂糖凝胶板，加样6μL~8μL，电压80V~100V，电流40mA~50mA，电泳30min~ 40min。 5.4.5结果判定 如果不出现940bp和637bp大小的片段，判定为阴性；如果出现940bp和637bp中的任何一个片 段则判定为阳性，并对PCR产物进行测序，与参考毒株进行序列比对。 3