ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 27639—2011 结核病病原菌实时荧光PCR检测方法 Real-time PCR method for the detection of tuberculosis pathogenic organisms 2011-12-30发布 2012-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27639—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、华中农业大学、中国检验检疫科学研究 院、北京盈九思科技发展有限公司。 本标准主要起草人：陈茹、刘中勇、杨国海、郭爱珍、曾碧健、韩雪清、高小博、林祥梅、吴晓薇。 STIC I GB/T 27639—2011 结核病病原菌实时荧光PCR检测方法 1 范围 本标准规定了结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌实时荧光PCR检测方法的技术要 求和操作规范 复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682一2008分析实验室用水规格和试验方法 GB19489—2008实验室生物安全通用要求 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值：荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数， dNTP：deoxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核苷三磷酸。 DMSO：dimethylsulfoxide，二甲基亚矾。 EDTA:ethylenediaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸。 PBS:phosphatebuffersolution，磷酸盐缓冲液 PCR：polymerasechain reaction，聚合酶链式反应。 Taq 酶:Taq DNA 聚合酶。 UDG酶：uracilDNAglycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶。 4原理 本标准方法采用了TaqMan探针实时荧光PCR技术原理。反应体系中包括一对用于扩增DNA 的引物，和一条能与PCR产物特异杂交的荧光标记探针。探针的5端标记了被称为报告基团的荧光 素，3端标记了淬灭基团。在进行PCR延伸反应时，Taq酶的5'外切酶活性将5端荧光基团从探针上 切割下来，使其与淬灭基团分离，从而仪器能检测到5端荧光基团所发出的荧光信号，一分子PCR扩 增产物的生成伴随一分子荧光信号的产生。随着扩增循环次数的增加，仪器检测到的荧光信号的累积 反应了扩增产物量的变化 本标准提供特异检测结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌和牛分枝杆菌共四套实时荧光PCR检测 方法（见表1）。其中，结核分枝杆菌复合群特异的实时荧光PCR方法分别以IS6110、IS1081插人基因 序列为模板设计特异扩增引物与探针；结核分枝杆菌、牛分枝杆菌特异的实时荧光PCR方法分别以菌 种特异的基因组序列为模板设计特异扩增引物与探针。 1 GB/T 27639—2011 表1 荧光PCR引物与探针序列 类别 核酸序列 上游引物:5'GCAGGGTTCGCCTACGTG3” 结核分枝杆菌复合 下游引物：5'CGGGTCCAGATGGCTTGC3 群（IS6110) 探针°:5-FAM-TGTCACCGACGCCTACGCTCGC3'-BHQ-1 上游引物：5'CCAGGAACGCCTCAACC3” 结核分枝杆菌复合 下游引物：5'CGACGAGGCGGATGATC3' 群（IS1081) 探针":5*-FAM-AGAGGTACGACGCCGAACCGAC-BHQ-1 上游引物:5'CGG TGT AAT CAG TTT TGA AGC 3' 结核分枝杆菌 下游引物:5'CGATTGGAACGGCGAAGC3 探针°:5'-FAM-TAGGTAGTCCAGTAGAGCCCCATAGCCA3'-BHQ-1 上游引物：5'ACGCCTTCCTAACCAGAATTG3” 牛分枝杆菌 下游引物:5'GGC TATTGACCAGCTAAGATATCC3 探针":5'-FAM-AATTCATACAAGCCGTAGTCGTGCAGAA3'-BHQ-1 探针5端标记的报告荧光基团及3端标记的淬灭基团可根据荧光PCR仪设备等具体情况另行选定。 5 材料与试剂 5.1 仪器与耗材 5. 1. 1 接种棒。 5.1. 2 无菌注射器或真空采血管。 5. 1. 3 灭菌容器。 5. 1. 4 橡胶管。 5. 1. 5 刮匙。 5.1. 6 Ⅱ级生物安全柜。 5.1.7 荧光PCR仪。 5.1.8 恒温水浴锅（室温至100℃）。 5.1.9 离心机（最高离心力达15000×g以上）。 5. 1. 10 混匀器。 5. 1. 11 冰箱（2℃~8℃，-20℃，-80℃)。 5. 1. 12 天平（精密度达千分之一以上）。 5.1.13 微量可调移液器（10μL，100μL，1000μL）。 5.1. 14 微量带滤芯吸嘴（10μL,100μL，1000μL）。 5.1.15 研钵。 5.1.16 离心管。 5.1. 17 PCR光学反应管。 5. 2 试剂 5.2.1 试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682一2008规定的二级水，所用化学试 2 GB/T27639—2011 剂均为分析纯。 5.2.2引物与探针：采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与探针（序列见表1)配制成100μmol/L 储存液，置一20℃或更低温度冻存；使用时取适量配制成10μmol/L工作液，避免多次冻融。 5.2.30.01mol/LpH7.6PBS：配方见A.1。 5.2.4柠檬酸钠缓冲液：配方见A.2。 5.2.50.5mol/LEDTA:配方见A.3。 5.2.6柠檬酸钠-磷酸缓冲液：配方见A.4。 5.2.74%氢氧化钠溶液：配方见A.5。 5.2.8 4%硫酸溶液：配方见A.6。 5.2.9 TritonX-100。 5.2.10 DNA提取液:含100mmol/LTris-HCl（pH8.0),0.01% Triton X-100,200μg/μL蛋白酶K。 也可采用等效商品化试剂。 5.2.113 灭菌双蒸水。 5.2.12 三氯甲烷。 5.2.13 异丙醇。 5.2.14 无水乙醇。 5.2. 15 70%乙醇：用新开启的灭菌双蒸水配制，一20℃预冷。 5.2.16 荧光PCR反应缓冲液：含50mmol/LKCl，10mmol/LTris-HCl（pH8.3），2.5mmol/L MgCl2，5%二甲基亚砜（DMSO），5%甘油。可采用等效商品化试剂。 5. 2. 17 7 dNTP: dATP、dUTP、dCTP 和 dGTP。 5.2. 18 Taq酶。 5.2.19 UDG酶。 6生物安全要求 采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守GB19489一2008的有关规定。 7采样 7.1样品采集 7.1.1细菌培养物 直接取液体培养基培养的菌液；对于在固体培养基上生长的菌落，用接种棒挑取适量（取用量达到 肉眼可见，菌团大小不超过接种环）菌样，放到0.01mol/LpH7.6PBS中，振荡混匀形成悬浮菌液 7.1. 2血样 用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血，无菌分离血清。 用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血，将血液直接滴入抗凝剂中，并立即连续摇动，充 分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或0.5mol/LEDTA。每6mL血液加1mL抗凝剂。 条件允许时，建议优先采集全血，以更有利于富集菌体。 7.1.3奶样 无菌采集奶液于灭菌的容器中。一般以后段奶液含菌量较多，早晨挤出的奶液含菌量最高。 3 SAC