ICS 11. 020 05 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T26351—2010 抗药性检测方法 德国小不敏感乙酰胆碱酯酶法 Test methods of cockroach resistance to insecticides- Test methods of insensitive acetylcholinesterase for Blattella germanica 2011-01-14发布 2011-05-01实施 中华人民共和国卫生部 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T26351—2010 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准起草单位：北京市疾病预防控制中心、中国农业大学、中国人民解放军军事医学科学院微生 物流行病研究所。 本标准主要起草人：曾晓芃、高希武、马彦、钱坤、佟颖、梁沛、赵彤言。 1 GB/T26351—2010 抗药性检测方法 德国小不敏感乙酰胆碱酯酶法 1范围 本标准规定了德国小（Blattellagermanica）体内不敏感乙酰胆碱酯酶（AChE)的检测方法。 本标准适用于德国小对有机磷、氨基甲酸酯类药剂抗药性的生物化学检测 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2. 1 乙酰胆碱酯酶区分浓度 discriminating concentrationof acetylcholinesterase 能够抑制敏感品系德国小乙酰胆碱酯酶正常活性90%的杀虫药剂的浓度，单位为mol/L或 mmol/L. 2. 2 F1代 F1generation 从现场捕捉的德国小，繁殖后得到的第一代。 3试虫 现场采集德国小，室内饲养，F1代羽化后7d～15d的雄性德国小。冰浴条件下储存不超过 4试剂 4.1磷酸氢二钠（NazHPO,）,化学纯。 4.2磷酸二氢钾（KH,PO,），化学纯。 4.3曲拉通X-100（TritonX-100）。 4.4乙酰硫代胆碱（ATCh），分析纯。 4.55,5-二硫双硝基苯甲酸（DTNB），分析纯。 4.6磷酸缓冲液（0.1mol/L.pH7.5PBS):称取30.18gNazHPO4·12HO和2.16gKH,PO4,蒸馏 水定容至1000mL。 4.7DTNB-乙醇显色剂：称取12.4mgDTNB,溶于125mL95%乙醇中，加人50mL磷酸缓冲液，最 后用蒸馏水定容至250mL，4℃避光保存。 4. 8 ATCh溶液：称取28.9mgATCh溶于10mL蒸馏水中，一20℃避光保存。 4.9 ATCh-DTNB混合溶液：称取75mgATCh和13mgDTNB，用1o0mL磷酸盐缓冲液溶解。 GB/T26351—2010 5分光光度法 5.1仪器设备 5.1.1分光光度计。 5.1.2恒温水浴箱。 5.1.3玻璃组织匀浆器。 5.1.4台式冷冻离心机（离心力10000g以上）。 5.1.5 、加液器。 5.2杀虫药剂的配制 用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液，实验前用磷酸盐缓冲液稀释到区分浓度（常见杀 虫药剂对敏感德国小品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度参见附录A)的2倍，溶剂在反应体系中的最终浓 度应小于1%。 5.3操作步骤 冲液（pH7.5，0.1mol/L，含0.1%TritonX-100），充分匀浆。 5.3.2匀浆液在4℃，10，000g，离心15min，弃沉淀，取上清即为酶液，冰浴保存备用。 5.3.3取4支试管，分别加入上述酶液0.1mL，在其中3支试管中分别加人杀虫药剂水溶液0.1mL， 使其终浓度达到区分浓度，第4支试管中加入0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照管，另取1支试管 加入0.2mL磷酸盐缓冲液，作为空白对照。 5.3.4将上述5支试管于30℃保温5min，再分别加人0.1mL乙酰硫代胆碱（ATCh），30℃继续保 温15min后,加人1.6mLDTNB-乙醇显色剂。 5.3.5以空白对照调分光光度计0点，于412nm波长下测定无药剂对照管和药剂处理管的光密度值 (ODa12)。 5.3.6按上述方法检测100头德国小。 5.4结果表述 测定AChE残存活性的计算见公式（1）。 OD×100% E- .(1) OD. 式中： E 一AChE残存活性； OD——药剂处理管平均光密度值OD412； OD。—无药剂对照管平均光密度值OD412。 5.5判别标准 AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE。具有不敏感AChE的个体为对有机磷或氨基甲酸酯 类药剂具有抗性的个体，抗性个体在种群中的比例达到10%时为抗性种群。 2 GB/T26351—2010 6酶标仪法 6.1仪器设备 6.1.1酶标仪。 6.1.2恒温水浴箱。 6.1.3玻璃组织匀浆器。 6. 1. 4 台式冷冻离心机（离心力10000g以上）。 6. 1. 5 ：加液器。 6.2杀虫药剂的配制 用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液，实验前用磷酸盐缓冲液稀释到区分浓度（常见杀 虫药剂对敏感德国小乙酰胆碱酯酶的区分浓度参见附录A）的2.5倍，溶剂在反应体系中的最终浓度 应小于1%。 6.3操作步骤 6.3.1将单头德国小雄成虫，放人4℃预冷的玻璃组织匀浆器中，加人1mL4℃预冷的磷酸盐缓冲 液（pH7.5,0.1mol/L，含0.1%TritonX-100），充分匀浆。 6.3.2匀浆液在4℃，10000g离心15min，弃沉淀，取上清即为酶液，冰浴保存备用。 药剂溶液0.05mL，使其终浓度达到区分浓度，第4个孔中加入0.05mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对 照管，在30℃保温5min后，分别加人0.1mLATCh-DTNB混合溶液，在412nm测定5min时间动 力学曲线，曲线的斜率作为反应初速度（の）。计算平均值 6.4结果表述 测定AChE残存活性的计算见公式（2）。 :(2) 式中： E AChE残存活性； 药剂处理组平均反应初速度： Ue 一一无药剂对照组平均反应初速度。 6.5判别标准 AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE。具有不敏感AChE的个体为对有机磷或氨基甲酸酯 类药剂具有抗性的个体，抗性个体在种群中的比例达到10%时为抗性种群。