ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 31797—2015 啤酒花潜隐类病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Hop latent viroid 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T31797—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫 局、中华人民共和国新疆出人境检验检疫局、中国农业科学研究院植物保护研究所、石河子大学。 本标准主要起草人：郭立新、邓丛良、段维军、张祥林、李世访、姜冬梅、荣德福、刘升学。 I GB/T31797—2015 啤酒花潜隐类病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了啤酒花潜隐类病毒的检疫鉴定方法。 本标准适用于啤酒花（Humuluslupulus）及其无性繁殖材料、种子、花粉上啤酒花潜隐类病毒的检 疫鉴定，同时也适用于草（Humulusjaponicus）和异株尊麻（Urticadioica）上啤酒花潜隐类病毒的检 疫鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3仪器设备、主要用具和主要试剂 3.1仪器设备 电子天平（感量0.001g）、普通天平（感量0.1g）高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超 低温冰箱（一80℃）、制冰机、涡旋振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、PH计、PCR仪、微波炉、电泳仪、电 泳槽、凝胶分析成像系统、实时荧光PCR仪、杂交炉、塑料薄膜封口机、紫外交联仪、暗箱、摇床、可调移 液器（2.5μl10μl，20μl200μl,1000μL,5000μL) 3.2主要用具 无RNase吸头（10μL，20μL，200μL，1000μL,5000μL)无RNase离心管（1.5mL,5mL， 袋、X光片。 3.3主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。RT-PCR检测试 剂见附录B；实时荧光RT-PCR检测试剂见附录C;斑点杂交检测试剂见附录D。 4检测样品制备 4.1种子类 随机抽取至少50粒种子样品，进行表面消毒后，置于铺有吸水纸的白瓷盘或培养皿中，在适宜的发 芽温度条件下催芽，直至长出第一对真叶（发芽时间大约一周）：或者在消毒的土壤中直接种植，直至长 出第一对真叶。取适量叶片，放人洁净的研钵中，加人液氮后迅速研磨成细粉状。 1 GB/T31797—2015 4.2种苗类 对于有症状的种苗类样品选取全部表现症状种苗类样品的叶片，对于无症状的种苗类样品选取适 量样品的叶片，放入洁净的研钵中，加液氮后迅速研磨成细粉状。 5检测与鉴定 5.1 试验设计 每个样品设置两个平行反应。检测时以感染啤酒花潜隐类病毒的植物组织作为阳性对照，以健康 植物组织作为阴性对照，以双蒸水代替模板作为空白对照 5.2普通RT-PCR方法 普通RT-PCR方法见附录B。 5.3实时荧光RT-PCR方法 实时荧光RT-PCR方法见附录C。 5.4斑点杂交方法 斑点杂交方法见附录D。 6结果判定 样品经普通RT-PCR检测为阳性，且实时荧光RT-PCR检测为阳性或斑点杂交检测为阳性，则判 定为检出啤酒花潜隐类病毒。 样品经普通RT-PCR检测为阳性，且序列测定结果与已知的HpLVd序列一致，则判定为检出啤酒 花潜隐类病毒。 7结果记录与样品保存 7.1结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，试验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员 和审核人员签字。普通RT-PCR检测结果保存电泳照片，实时荧光RT-PCR检测结果保存荧光曲线图 及Ct值，斑点杂交检测保存照片，序列测定结果保存测序报告图。 7.2样品保存与处理 样品经登记人和经手人签字后妥善保存3个月，种子保存在干燥条件下或4℃冰箱内，生长苗木保 存在隔离温室中，其他繁殖材料可取实验样品在一80℃冰箱内保存。对检出啤酒花潜隐类病毒的样品 应至少保存6个月，以备复检、谈判和仲裁。保存期满后，应灭活处理 2 GB/T31797—2015 附录A （资料性附录） 啤酒花潜隐类病毒相关资料 A.1背景资料 A.1.1 啤酒花潜隐类病毒基本信息 学名：Hop latent viroid。 缩写：HpLVd。 分类地位：马铃薯纺锤形块茎类病毒科（Pospiuiroidae）、椰子死亡类病毒属（Cocaduiroid）。 A.1.2 2方法原理 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、实时荧光RT-PCR反应及斑点杂交方法是本标准制定的主要依据。 A.2 寄主范围 HpLVd寄主范围较窄，仅侵染啤酒花（Humuluslupulus）、蕉草（Humulusjaponicus）和异株荨麻 (Urtica dioica)。 A.3 病害症状 寄主受HpLVd侵染后一般不表现症状，但在英国，啤酒花Omega品种受HpLVd侵染后，出现萎 黄、生长缓慢及球果较小等症状。 A.4分布地区 欧洲：比利时、捷克、英国、法国、德国、匈牙利、波兰、葡萄牙、俄罗斯、西班牙、南斯拉夫 亚洲：日本、韩国、中国（新疆）。 美洲：巴西、美国。 非洲：南非。 大洋洲：澳大利亚。 A.5 传播方式 HpLVd主要通过无性繁殖材料、农事操作工具进行传播；也可通过种子（8%传毒率）、花粉传播， 但传毒率很低；至今尚无昆虫介体传播的报道 A.6 基因组 HpLVd通过不对称滚环模式进行复制，基因组不编码蛋白质。 3