ICS 65.020.010 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 31793—2015 油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Leptosphaeria maculans (Fuckel) Ces.et De Not 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 31793—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：吴品珊、易建平、周国梁、杜洪忠。 I GB/T31793—2015 油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定方法。 和鉴定。 2仪器和用具 2.1仪器 电子天平（感量0.01g）、生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、高压灭菌 锅、制冰机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、实时荧光PCR仪、培养箱、冰箱。 2.2用具 烧杯、三角瓶、量筒、培养血、酒精灯、镊子、剪刀、解剖刀、接种针、载玻片、盖玻片、研钵、移液器、移 液器吸头、离心管、液氮罐、孔径2.5mm和1.5mm的网筛。 3试剂和培养基 3.1试剂 1.0%次氯酸钠（NaC1O），琼脂粉，马铃薯，葡萄糖，乳酸，琼脂糖，无菌双蒸水，液氮，蛋白陈，磷酸二 氢钾，硫酸镁，链霉素，新霉素，五氯硝基苯，氯四环素，利福平，Tris-HCl,MgCl2，HCI,EDTA，NaOH， NaOAc,KCl,Tris，CTAB，TAE,无水乙醇（ethanol)，苯酚（phenol)，溴化乙锭（EB)，三氯甲烷（chloro form），异丙醇（isopropanol)，异戊醇（isoamylalcohol)，蛋白酶K，TaqDNA聚合酶，dNTP,DNA相对 分子质量标准物，PCR特异性引物和实时荧光PCR特异性引物及探针。 3.2培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），酸性马铃薯葡萄糖琼脂培养基（APDA）。：具体配方参见附录A 4检疫鉴定方法 4.1种子检测 未带有种衣剂的种子，解剖镜下挑取皱缩、干癌、变色、畸形、残缺或有霉变的种子1g～2g；带有种 衣剂的种子，先用自来水浸泡洗去种衣剂，或用纱布包裹浸泡搓洗种子，自来水冲洗去种衣剂，待风干后 挑取异常种子，做分离培养。 商用油菜籽样品取1kg，用孔径2.5mm和1.5mm的网筛过筛，孔径2.5mm筛上物多为豆荚和 茎等植株残体，孔径1.5mm筛下物多为碎屑和细小油菜籽。筛上物和筛下物混匀后，取1g～2g制 样，进行PCR初检，初检如果阳性，再挑取异常种子做分离培养。 1 GB/T31793—2015 4.2植株症状检查 检查植物的根、茎和叶片等部位，对茎部溃疡黑斑、根部变色黑腐、叶上有灰色斑点的植物，取样送 实验室做进一步检验。油菜茎基溃疡病菌为害症状参见附录A。 4.3分离培养 种子样品用无菌水室温浸泡0.5h~1h无菌水洗涤3次后加无菌水浸泡，置于20℃～25℃培 养1d；无菌水洗涤3次后转入一20℃下冷冻处理过夜；1%次氯酸钠消毒10min，无菌水3次洗涤后置 于APDA培养基上，30粒/皿～40粒/皿；20℃下黑暗培养10d。 取可疑症状的根、茎、叶的病健交界处，剪成5mmX5mm小块，1%的次氯酸钠溶液消毒5min，无 菌水冲洗3次，吸干水分，置APDA培养基上，20℃下黑暗培养10d。 4.4形态学鉴定 在APD培养基上，从第3天开始观察分离样品周围是否有菌丝产生，挑出菌丝转接到PDA培养基 上，20℃下黑暗纯化培养，5d～7d后开始观察记录病菌的培养性状，显微镜下观察记录分生孢子和分 生孢子器的形态和大小。 4.5分子生物学鉴定 4.5.1DNA提取 将制备的商用油菜籽初检样品用液氮研磨后，取样0.1g～0.2g，采用CTAB方法提取DNA（参见 附录 B)。 将分离到的真菌菌丝收集，放入1.5mL浸在液氮里的离心管中，用塑料杆碾碎，采用CTAB方法 提取DNA(参见附录B)。 4.5.2PCR检测 常规PCR方法一：特异性引物Lm3（5'-GCCCACCAATTGGATCCCCTA-3'）和Lm4（5'-AG GCGAGTCCCAAGTGGAACA-3'）。PCR反应总体积为30μL，包含10mmol/LTris-HCl,50mmol/L KCl(pH8.3)，2.5mmol/LMgCl2dATP、dGTP、dCTP、dTTP浓度均为100μmol/L，引物浓度各为 100nmol/L，2μL模板DNA，1.5UTaqDNA聚合酶。反应循环程序为：94℃3min；94℃30s，67℃ 1.5%琼脂糖凝胶1XTAE缓冲液中，4V/cm6V/cm电泳30min，溴化乙锭（EB）染色后在成像系统 中成像分析。 常规PCR方法二：特异性引物LmacF（5'-CTTGCCCACCAATTGGATCCCCTA-3'）和LmacR (5'-GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG-3'）。PCR反应总体积为30μL，包含10mmol/LTris-HCl, 50mmol/LKCl(pH8.3),2.5mmol/LMgCl2.dATPdGTP.dCTP,dTTP浓度均为100μmol/L引l物 浓度各为100nmol/L，2uL模板DNA，1.5UTaqDNA聚合酶。反应循环程序为：94℃3min；94℃ 30s.63℃30s.72℃40s，35个循环；最后72℃5min。取10μL扩增产物与3μL的6X×上样缓冲液 混匀，在1.5%琼脂糖凝胶1XTAE缓冲液中，4V/cm~6V/cm电泳30min，溴化乙锭（EB)染色后在 成像系统中成像分析。 套式PCR：第一轮扩增引物Lm2（5'-TCAGTGGCGGCAGTCTACTT-3）和Lm6（5-GCCGGCT GCCAATTGTTTCA-3），第二轮扩增引物Lm3（5'-GCCCACCAATTGGATCCCCTA-3'）和Lm4（5 GB/T31793—2015 AGGCGAGTCCCAAGTGGAACA-3'）。PCR反应总体积为30μL，包含10mmol/LTris-HCl， 50mmol/LKCl(pH8.3),1.5mmol/LMgCl2,dATP,dGTP,dCTP,dTTP浓度均为100μmol/L,引物 浓度各为100nmol/L，模板DNA为2μL，1.5UTaqDNA聚合酶。反应循环程序为94℃3min； 94℃30s，67℃（引物Lm2/6为60℃）30s，72℃30s，35个循环（引物Lm2/Lm6第一轮扩增25个 循环）；最后72℃5min。第一轮扩增产物1μL用作第二轮扩增的模板。取10μL扩增产物与3μL的 6×上样缓冲液混，在1.5%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中，4V/cm~6V/cm电泳30min，漠化乙锭 (EB)染色后在成像系统中成像分析。 实时荧光PCR：引物Lm3（5-GCCCACCAATTGGATCCCCTA-3')/R2（5'-GGCGCAAAAT GTGCTGCGCT-3），探针Probe-M（5-FAM-CACTTGGGACTCGC-MGB-3）。PCR反应体系为 25μL，包括12.5μL2×PremixExTaq、上下游引物（5μmol/L）和探针（5μmol/L）各1μL、2μL模板 DNA0.5μL50XROXReferenceDyeIl，加无菌水补至25μL。反应程序为：95℃10s；95℃15s， 60℃1min，40个循环。 5鉴定特征 5.1病菌形态 初生菌丝无色，有分隔；菌丝呈白色放射状，初期可见结节状菌丝结，后期菌丝结形成黑色至褐色分 生孢子器；分生孢子器球形至扁球形，褐色至深黑褐色，散生、埋生或半埋生于菌丝中，直径100μm～ 400um，顶部具孔口，周围有浅粉色、红色或紫色的黏性分生孢子团溢出，内含大量的分生孢子；分生孢 子无色透明，椭圆形至纺锤形，内含2个油球，孢子大小（3.3μm～6.1μm）×（1.4μm～2.4μm）。 孢子长椭圆形，黄褐色，具5个隔膜，大小（30μm～70μm）×（4um～9μm）。人工培养条件下未见有 性型的形成。 病菌形态图参见附录C中图C.1，与其近似种的形态比较参见附录D中表D.1。 5.2PCR检测 如常规PCR引物Lm3/Lm4扩增产物为279bp，或引物LmacF/LmacR扩增产物为331bp，视为 油菜茎基溃疡病菌阳性。 如套式PCR引物Lm2/Lm6和Lm3/Lm4扩增产物为279bp，视为油菜茎基溃疡病菌阳性。 实时荧光PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下： Ct值小于或等于36，判定油菜茎基溃疡病菌阳性； 一Ct值大于或等于40，判定油菜茎基溃疡病菌阴性； 一Ct值在36～40之间，应重做实时荧光PCR，再次扩增后如Ct值小于或等于36，或者Ct值大 于或等于40，判定同上。 6结果判定 分离菌形态特征与5.1描述一致，且常规PCR、套式PCR或实时荧光PCR检测为阳性，可判定为 油菜茎基溃疡病菌（Leptosphaeriamaculans）。 3