ICS 07.080 G 60 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T30990—2014 溶菌酶活性检测方法 Determination of the activity of lysozyme 2014-07-24发布 2015-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T30990—2014 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。 本标准起草单位：深圳市计量质量检测研究院、中国测试技术研究院、珠海出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：赖晓芳、谭和平、林霖、孙登峰、赖心田、兰全学、杨国武、李意、李浙、潘兰芳 杨泽、莫秋华。 I GB/T30990—2014 溶菌酶活性检测方法 1范围 本标准规定了溶菌酶活性检测方法 本标准适用于生化试剂、不同工业产品及其原料中溶菌酶活性的测定 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 溶菌酶lysozyme 一种葡萄糖苷酶，通过其肽链中的Glu35和Asp52残基构成的活性部位催化水解细菌细胞壁中的 N-乙酰胞壁酸的C1与N-乙酰氨基葡糖的C4之间的β-糖苷键，从而迅速溶解细菌细胞壁中的多糖 成分。 注：又名球蛋白G、胞壁质酶、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶 3.2 溶菌酶活性 lysozymeactivity 在25℃，0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.2)中，以溶壁微球菌为底物，于450nm处每分钟使吸光 度值下降0.001时所需的酶量。活性单位为U/mg或U/g或U/mL。 4原理 本检测方法以溶壁微球菌（Micrococcuslysodeikticus）为反应底物，使用溶菌酶催化水解其细胞 壁，细菌因失去细胞壁的保护无法维持细胞内渗透压平衡而裂解死亡，导致菌悬液的浊度降低，通过紫 外一可见分光光度计测定在450nm处的吸光光度值的变化并换算出样品酶活性单位。 5仪器设备及器具 5.1生物安全柜。 5.2灭菌锅。 5.3# 摇床：（37±1）℃。 5.4 恒温培养箱：（37土1）℃。 5.5 离心机：可达12000g/min。 1 GB/T30990—2014 5.6pH计：精确至0.01pH。 5.7 电子天平：分度为0.001g。 5.8 恒温水浴锅：（25士1）℃。 5.9# 紫外-可见分光光度计：吸光度值精确至0.001。 5.10 ）石英比色皿：1cm。 5.11微量移液器：100μL~1000μL。 6 试剂 6.1总则 除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6882规定的三级水。 6.2磷酸盐缓冲液（pH6.2) 二水合磷酸二氢钠11.71g，十二水合磷酸氢二钠7.85g，定容至1L。 6.30.1mol/L氢氧化钠 称0.4g氢氧化钠充分溶解于50mL去离子水，定容至100mL，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）， 4℃保存备用，用时恢复至室温。 6.4液体LB培养基 胰蛋白陈10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加适量去离子水充分溶解，采用0.1mol/L氢氧化钠 （6.3）调节pH至7.4，并定容至1L。高压蒸汽灭菌（121℃，20min）。4℃保存备用，用时恢复至室温 6.5LB琼脂斜面 胰蛋白陈10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉20g，加适量去离子水充分溶解，采用 0.1mol/L氢氧化钠（6.3）调节pH至7.4，并定容至1L。高压蒸汽灭菌（121℃，20min）。采用无菌试 管，分装制成琼脂斜面，4℃保存备用，用时恢复至室温。 6.6LB琼脂平板 胰蛋白陈10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉20g，加适量去离子水充分溶解，采用 0.1mol/L氢氧化钠（6.3）调节pH至7.4，并定容至1L。高压蒸汽灭菌（121℃，20min）。采用无菌平 Ⅲ，分装制成琼脂平板，4℃保存备用，用时恢复至室温。 7分析步骤 7.1反应底物制备 注：若市售溶壁微球菌冻干粉经验证与经上述制备的反应底物等效，则可直接使用。 7.1.1菌株复苏 以无菌操作方式，取0.5ml液体LB培养基（6.4），滴人装有溶壁微球菌标准菌株（Micrococcusly sodeikticusFleming，CGMCC1.634)冻干粉的安瓶中，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状。将菌体 悬浮液移植入LB琼脂斜面（6.5），37℃培养箱，培养18h～24h。4℃保存备用。 2 GB/T30990—2014 7.1.2菌株扩大培养 以无菌操作方式，挑取适量菌体至LB琼脂平板（6.6)中划线纯化，在（37士1)℃培养箱中培养24h， 并观察单菌落形态。选取湿润，凸起，边缘光滑，呈黄色的菌落，于LB琼脂平板（6.6）中再次划线纯化， 在（37士1）℃培养箱中培养24h。平板于4℃保存，一个月内使用。 挑取二次划线纯化的LB琼脂平板（6.6）中的单菌落于50mL液体LB培养基（6.4)中混匀，于 （37士1）℃恒温摇床中，110r/min摇菌18h后于4℃保存，用时恢复至室温，一周内使用。 取500uL菌液至50mL液体LB培养基（6.4）中混匀，于（37土1）℃恒温摇床中，110r/min摇菌 18h后用于制备菌悬液。 7.1.3菌悬液制备 将菌液（7.1.2）离心（12000g，5min）收集菌体，采用磷酸盐缓冲液（6.2）洗涤菌体至无培养基 状态。 开机（5.9），调波长至450nm，于（25土1）℃室温预热，将一定量菌体悬浮于按6.2配制的磷酸盐缓 冲液中，调节菌体浓度，使450nm处吸光度值为1.300。 7.2测定 7.2.1试样制备 7.2.1.1前处理 工业产品及其原料应充分溶解，除去不溶物后再进行量取；鸡蛋样品应采用蛋清分离器取其蛋清后 再进行称重。 7.2.1.2 生化试剂 准确称取1mg（精确至0.001g)固体酶粉或量取1mL(精确至0.01mL)液体酶液，于适量磷酸盐 缓冲液中，用磷酸盐缓冲液（6.2)稀释，使其1.min内吸光度值变化量处于0.025~0.125，且1min时读 值不应小于1.000。同一试样进行平行试验测定。 7.2.1.3工业产品及原料 准确称取1g（精确至0.01g）样品，于适量磷酸盐缓冲液（6.2）使其充分溶解并定容至100mL使 其1min内吸光度值变化量处于0.025～0.125，且1min时读值不应小于1.000。同一试样进行平行试 验测定。 7.2.2检测 于（25土1）℃的室温或恒温水浴锅中，于反应管中加人2.5mL菌悬液（7.1.3），加人0.5mL酶液， 反应1min时记录450nm处的读数Al，反应2min时记录450nm处的读数A2。通过公式换算得出 对应的酶活性。每个样品做两个平行。 8结果 8.1结果计算 用式(1)计算酶活性：