说明:收录25万 73个行业的国家标准 支持批量下载
ICS65.020.30 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 37115—2018 鲍疱疹病毒病诊断规程 Protocol of diagnosis for infection with abalone herpersvirus 2018-12-28发布 2019-07-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T37115—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。 本标准主要起草人:王津津、李清、余卫忠、刘、刘莹、史秀杰、郑晓聪、何俊强、于力、贾鹏、兰文升。 GB/T37115—2018 鲍疱疹病毒病诊断规程 1范围 本标准给出了鲍疱疹病毒病的临床症状,规定了鲍疱疹病毒病组织病理学检测方法、实时荧光聚合 酶链式反应检测方法、聚合酶链式反应检测方法。 本标准适用于鲍疱疹病毒病的流行病学调查、监测、诊断和检疫。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AbHV:鲍疱疹病毒(AbaloneHerpesvirus) CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(CetyltrimethylAmmoniumBromide) Ct值:循环阈值(Cyclethreshold) EB:溴化乙锭(EthidiumBromide) EDTA:乙二胺四乙酸(EthyleneDiamineTetraaceticAcid) PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction) qPCR:实时荧光聚合酶链式反应(quantitativereal-timePolymeraseChainReaction) 4. 试剂和材料 4.1 若非注明,本标准所用生化试剂均为分析纯的试剂 4.2若非注明,试验用水应符合GB/T6682一级水的规格。 4.3 Taq酶及10倍Taq酶浓缩缓冲液;Taq酶浓度为5U/μL,一20℃保存,避免反复冻融。 4.4dNTPs:含dCTP,dGTP、dATP、dTTP各10mmoL/L。 4.5 5qPCR引物和探针: AbHV ORF66F1:5'-CCCGGACACCAGTAAGAAC-3 AbHV ORF66R1:5'-AGGCTGCTATGCGTATGA-3' 扩增ORF66基因长度146bp片段,用于荧光PCR。(参见附录A) AbHV ORF77F1:5'-AACCACTTGTTCGGGTTCT-3° AbHV ORF77R1:5'-AGGGTGATTAATGCGGAGT-3 1 GB/T 37115—2018 扩增ORF77基因长度190bp片段,用于荧光PCR。(参见附录A) 6内对照引物: 4.6 18sF1:5'-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3 18sR1:5'- GCTGGAATTACCGCGGCT-3° 探针(18s rRNA):5'-6VIC-TGCTGGCACCAGACTTGCCCTC-TAMRA-3 扩增鲍18srRNA基因长度187bp片段,用于荧光PCR。(参见附录A) 4.7 PCR引物: AbHV-16:5-GGCTCGTTCGGTCGTAGAATG-3 AbHV-17:5'-TCAGCGTGTACAGATCCATGT-C-3 扩增片段大小为522bp~558bp。(参见附录A) 4.8 电泳缓冲液。 4.9琼脂糖。 4.10 组织切片制备和染色试剂(见附录B)。 5 器材和设备 切片机。 5.1 5.2 显微镜。 5.3 荧光PCR检测仪和PCR扩增仪。 5.4组织研磨器。 5.5 5高速台式冷冻离心机。 5.6 超低温冰箱、普通冰箱 5.7 高压灭菌锅。 5.8 干燥箱。 5.9 生物安全柜。 5.10 凝胶成像仪。 5.11 电泳仪。 移液器。 5.12 6 临床症状 参见附录C。 7采样 7.1 采样对象 所有年龄段的易感鲍品种,包括有初期临床症状的鲍、濒死的鲍以及发病区域内的其他健康鲍。 7.2 采样数量 采样数量应符合SC/T7103的要求 2 GB/T 37115—2018 7.3样品采集 按GB/T18088的规定执行,取鲍含神经组织丰富的组织器官,包括脑神经节、侧足神经节等。 8组织病理学检测 8.1取样 取鲍的神经组织。 8.2固定 迅速将组织用Davidson氏固定液(见B.1)固定2h以上。根据组织块大小,固定时间可适当调整, 或放置过夜,期间按需要更换一次固定液。临床样品也可用10%甲醛固定,长期保存。 8.3切片 固定好的组织块用水充分洗涤,按下列程序处理:70%乙醇(60min)-→85%乙醇(60min)→95%乙 醇(60min)-→无水乙醇(2次,30min/次)→二甲苯十无水乙醇(体积比1:1)(30min)→二甲苯浸泡 据组织块大小和种类,各步时间作适当调整)。切片厚度不超过6μm。 8.4切片处理染色 二甲苯(5min)→二甲苯十无水乙醇(体积比1:1)(3min)→无水乙醇(3min)→95%乙醇(3min) 85%乙醇(3min)→70%乙醇(3min)→蒸馏水(5min)→苏木精(60min)→伊红(5min)→蒸馏水 (/)()%)%8) (体积比1:1)(5min)→二甲苯浸泡(2次,5min/次)→中性树脂封片。 8.5结果判定 9核酸鉴定 9.1样品处理 样品采取好运送到实验室后,在1.5mL离心管中首先加入25mg~100mg组织,加入150l CTAB溶液(见B.2),用组织研磨器将样品匀浆成糊状,再加CTAB溶液到900μuL。混匀后置于25℃ 作用2 h待用。 9.2核酸抽提 取前处理好的匀浆组织约20mg放人1.5mL微量离心管中,加800μL抽提液I(酚/三氯甲烷/ 异戊醇)(见B.3),充分混合30s;12000r/min离心5min,取上层水相:加700uL抽提液Ⅱ(三氯甲烷/ 异戊醇)(见B.4),用力混合30s;12000r/min离心5min,取上层水相:加1.5倍体积一20℃预冷的无 水乙醇,混勾后一20℃过夜以沉淀核酸。15000r/min离心30min,小心弃上清,立即用滤纸吸干(应 尽量充分吸干),37℃干燥20min或抽真空干燥;最后加10μL水溶解后,作为模板待用。 组织核酸提取也可采用等效的商品化核酸提取试剂盒,按照说明书进行操作。 3.

pdf文档 GB-T 37115-2018 鲍疱疹病毒病诊断规程

文档预览
中文文档 11 页 50 下载 1000 浏览 0 评论 0 收藏 3.0分
温馨提示:本文档共11页,可预览 3 页,如浏览全部内容或当前文档出现乱码,可开通会员下载原始文档
GB-T 37115-2018 鲍疱疹病毒病诊断规程 第 1 页 GB-T 37115-2018 鲍疱疹病毒病诊断规程 第 2 页 GB-T 37115-2018 鲍疱疹病毒病诊断规程 第 3 页
下载文档到电脑,方便使用
本文档由 思安 于 2023-02-02 22:13:13上传分享
站内资源均来自网友分享或网络收集整理,若无意中侵犯到您的权利,敬请联系我们微信(点击查看客服),我们将及时删除相关资源。