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ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 36875—2018 猪瘟病毒RT-nPCR检测方法 Method of RT-nPCR for detection of classical swine fever virus 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36875—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:军事医学科学院军事兽医研究所、中国兽医药品监察所。 本标准主要起草人:郭焕成、王琴、徐璐、冯烨、张乾义、赵启祖、邹兴启、朱元源、涂长春。 GB/T36875—2018 猪瘟病毒RT-nPCR检测方法 1范围 本标准规定了猪瘟病毒特异的反转录-套式聚合酶链反应(RT-nPCR)方法的技术要求。 本标准适用于可能感染猪瘟病毒的猪脏器、血液、粪便和细胞培养物中猪瘟病毒核酸的检测,可用 于猪瘟的诊断和监测 本标准的猪瘟病毒RT-nPCR方法不能区分感染的猪瘟病毒野毒株和免疫的疫苗株。 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate) EDTA-2Na:乙二胺四乙酸二钠(ethylene diaminetetraacetic acid disodium salt) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) RT-nPCR:反转录-套式聚合酶链反应(reversetranscriptionand nestedpolymerasechainreac tion) 3 实验前准备 3.1实验室条件 3.1.1实验室分区 PCR实验室分区包括核酸提取区、PCR反应体系配制区一一配液区、扩增区、电泳区。流程顺序为 3.1.2实验室应配备的仪器及器材 3.1.2.1仪器:Ⅱ级生物安全柜、台式高速冷冻离心机、普通冰箱(一20℃和4℃)、分析天平、PCR扩增 仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、组织研磨器、扁桃体采样器、微波炉、单道可调移 液器(2 μL、10 μL、200 μL、1 000 μL)。 3.1.2.2器材:无菌注射器、眼科剪、眼科镊、称量纸、棉拭子、灭菌牙签、500mL量筒、500mL锥形瓶、 一次性无RNA酶吸头(10μL、200uL、1000uL)、1.5mL无RNA酶离心管、0.2mL薄壁PCR管。 3.2化学药品及试剂 SAG 3.2.1总RNA提取试剂Trizol。 3.2.2TAE电泳缓冲液的制备,配制方法见附录A。 3.2.31%琼脂糖凝胶,配制方法见附录A。 3.2.4其他试剂:200U/uLM-MLV反转录酶,5XM-MLV缓冲液,40U/μLRNA酶抑制剂DEPC HzO,5U/μLExTaqDNA聚合酶,10XExTaq缓冲液(Mg2+Plus),6碱基随机引物(50μmol/L), 6×上样缓冲液,dNTPs(2.5mmol/L/dNTP),异丙醇,三氯甲烷,75%乙醇,ddH.O,漠化乙啶替代染 1 GB/T36875—2018 料,DL2000DNAMarker,阴性对照(DEPC-H,O),阳性对照(猪瘟免化弱毒疫苗、灭活的猪瘟病毒或已 知的阳性样品)。 3.2.5引物序列及配制方法,参见附录B。 4方法 4.1样品的采集、保存和运送 4.1.1采样注意事项 采样及样品前处理过程中应戴一次性手套,样品间不得交叉污染。 4.1.2菜样工具 扁桃体采样器:鼻捻子、开口器和采样枪。使用前均应用3%氢氧化钠溶液浸泡消毒5min~ 10min,经清水冲洗;牙签经121℃高压灭菌15min;剪、镊经160℃干烤2h。 4.1.3采样及样品处理方法 4.1.3.1扁桃体样品 用鼻捻子固定活猪的上额,用开口器打开口腔,用采样枪采取扁桃体样品,用灭菌牙签挑至1.5ml 离心管并做标记,编号,置于样品冷藏箱送至实验室。 在实验室生物安全柜中取出待检样品置于组织研磨器,加人5倍体积4℃预冷的DEPC-H2O,充 分研磨,4℃、3000×g离心15min,取上清液转人离心管中编号备用。 4.1.3.2组织样品 采取病死猪或安乐死的猪组织和脏器(淋巴结、脾脏、肾脏、肝脏和回肠等)装人一次性塑料袋或其 他灭菌容器,编号,置于样品冷藏箱送至实验室。 在实验室生物安全柜中取50mg~100mg待检组织样品置于组织研磨器,加人5倍体积4℃预冷 4.1.3.3全血样品 用无菌注射器采集全血,注入含1/10体积4%EDTA溶液的无菌容器中,充分混匀后编号备用。 4.1.3.4粪便样品 用棉拭子挑取少许新鲜粪便样品于离心管中,加人1mL生理盐水,震荡混匀,4℃、3000×g离心 15min,取上清液转人离心管中编号备用。其余液体排泄物离心后直接转入离心管编号备用。 4.1.3.5细胞培养物 51G 细胞培养物反复冻融3次,转人离心管中编号备用。 4.1.3.6存放与运送 采集或处理的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h;若需长期保存,应放置于一80℃冰箱, 且应避免反复冻融(冻融不超过3次)。采集的样品放入样品管中密封后,采用保温容器加冰袋或干冰, 在24h内运送到实验室。 2 GB/T36875—2018 4.2核酸提取 4.2.1提取样品总RNA,可采用本标准中的Trizol法,也可采用其他等效试剂盒,按照试剂盒说明书 进行。 4.2.2以猪瘟兔化弱毒疫苗、灭活的猪瘟病毒或已知的阳性样品作为阳性对照,以DEPC-H2O为阴性 对照。 4.2.3按以下Trizol法进行样品总RNA提取: 取待检样品、阳性对照和阴性对照各250L置于1.5mL离心管,每管加人750uLTrizol,一 份样品换一个吸头,充分混匀,静置10min; b) 每个样品管中加200μL三氯甲烷,混匀器上振荡混匀5s(不能过于强烈,以免产生乳化层,也 可以用手颠倒混匀),于4℃、13000×g离心15min; 用移液器转移离心后的上清液400μL(注意不要吸出中间层)至新1.5mL无RNA酶离心管 c) 中,加等体积的异丙醇(4℃预冷),颠倒混匀,一20℃静置20min; d)于4℃、13000×g离心15min,小心倒去上清液,加人700μLDEPC-H,O配制的75%乙醇, 颠倒洗涤; e) 于4℃、8000×g离心6min,小心倒去上清液,沉淀,室温干燥10min~15min; 加人20μLDEPC-H,O,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA沉淀,冰上保存备用。提取的RNA应 在2h内进行RT扩增,若需长期保存应放至一80℃冰箱。 4.3反转录 以随机引物为反转录引物,建立20μL反转录体系,制备cDNA: dNTPs 4.0μL 随机引物 1.5 μL 5XM-MLV缓冲液 4.0 μL 反转录酶M-MLV 1.0 μL RNA酶抑制剂 1.0 μL 总RNA 8.5 μL 42℃1.5h,95℃5min。 4.4建立50μL外套PCR反应体系 O"HPP 36.7 μL 10XExTaq缓冲液(Mg2+Plus) 5.0 μL 外套上游引物 1.0 μL 外套下游引物 1.0 μL dNTPs 4.0μL ExTaqDNA聚合酶 0.3 μL cDNA 2.0 μL PCR条件:95℃5min-→(95℃45 s-→55℃1min-→72℃1min)35个循环→72℃7min-→4℃。 4.5建立50μL内套PCR反应体系 取2μL外套PCR产物作为内套PCR的模板进行套式PCR,建立50μL内套PCR反应体系: O"HPP 36.7 μL 10×ExTaq缓冲液(Mg²+Plus) 5.0 μL 3 GB/T36875—2018 内套上游引物 1.0 μL 内套下游引物 1.0 μL dNTPs 4.0 μL ExTaqDNA聚合酶 0.3 μL 2.0 μL 外套PCR产物 PCR条件:95℃5min-(95℃45s→55℃1min→72℃45s)35个循环→72℃7min→4℃ 4.6电泳 4.6.1 配制适量的电泳及制胶用的缓冲液(通常是1XTAE)。 4.6.2 配制1%琼脂糖凝胶(见附录A)。 4.6.3 将琼脂糖溶液倒人制胶模中,然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般为4mm~5mm。 4.6.4 取5μL内套PCR产物与1μL6×上样缓冲液混匀,用移液器将其加人加样孔中。 4.6.5接通电源,以120V电压进行电泳,30min后停止电泳。 4.6.6 用凝胶成像仪观察并保存结果。 4.7 结果判定 阳性对照样品的内套PCR产物出现272bp扩增带,阴性对照无扩增带出现(引物二聚体带除外) 时,实验成立。被检样品的内套PCR产物出现272bp特异性条带时,判定样品为猪瘟病毒核酸检测阳 性,否则为阴性(见图1)。 M12 272 bp 说明: MDL2000 DNA Marker; 1 阳性对照; 阴性对照。 2 图1 套式RT-PCR检测结果的电泳图示例 4.8 基因测序 根据需要,可进一步将阳性PCR扩增产物用内套PCR上游、下游引物进行双向测序,获得CSFV 的PCR扩增区基因序列。 5注意事项 5.1样品的处理和检测应在生物安全IⅡI级(BSL-2级)或以上的实验室进行。疑似猪瘟样品的分装、研 磨、离心及添加RNA提取裂解液需在Ⅱ级生物安全柜内进行。检测后的废弃物品需浸入1%次氯酸钠 4 GB/T36875—2018 溶液的污物缸内30

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