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ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 35900.3—2018 动物流感检测 第3部分:H1和H3亚型流感病毒核酸 双重荧光RT-PCR检测方法 Animal influenza detectionPart 3 : Method of duplex real-time RT-PCR for the detection of H1 and H3 subtype influenza virus 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35900.3—2018 前言 GB/T35900《动物流感检测》目前分为3个部分: 第1部分:H1亚型流感病毒核酸荧光RT-PCR检测方法; 一第2部分:H3亚型流感病毒核酸荧光RT-PCR检测方法; 一第3部分:H1和H3亚型流感病毒核酸双重荧光RT-PCR检测方法。 本部分为GB/T35900的第3部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本部分由中华人民共和国农业部提出。 本部分由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本部分起草单位:中华人民共和国北京出人境检验检疫局 本部分主要起草人:蒲静、高志强、谷强、刘环、吴丹、乔彩霞、张伟、张鹤晓、张利峰 1 GB/T 35900.3—2018 引言 本文件的发布机构提请注意,声明符合本文件时,可能涉及到本文件4.1.8与“H1和H3亚型流感 病毒双重荧光RT-PCR检测引物和探针序列”相关的专利的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场 该专利持有人已向本文件的发布机构保证,他愿意向任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下, 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下 联系方式获得: 专利持有人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局。 地址:北京市朝阳区甜水园街6号。 请注意除上述专利外,本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专 利的责任。 GB/T35900.3—2018 动物流感检测 第3部分:H1和H3亚型流感病毒核酸 双重荧光RT-PCR检测方法 1范围 GB/T35900的本部分规定了同时检测H1和H3亚型流感病毒核酸的双重荧光RT-PCR操作 方法。 本部分适用于禽和猪及其产品中H1和H3亚型流感病毒核酸的检测 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19438.1—2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 GB19489实验室生物安全通用要求 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 荧光RT-PCR实时荧光反转录聚合酶链反应(real-timereversetranscriptpolymerasechainre action) BHQ1 无荧光淬灭基团(blackholequencher-1) Ct(或 Cp)值 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数(cyclethreshold,or crossing point) cRNA 互补RNA(complementRNA) DEPC 焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate) FAM 羧基荧光素(carboxyfluorescein) HA 血凝素(hemagglutinin) HEX 六氯-6-甲基荧光素(hexachlorofluorescein) LNA 锁核酸(locked nucleic acid) MGB 小沟结合物(minorgroovebinder) PBS 磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline) RNA 核糖核酸(ribonucleic acid) 试剂和材料 4 4.1试剂 4.1.1总则:除非另有说明,所用试剂均为分析纯,所用液体试剂均需使用无RNA酶的容器进行分装。 1 GB/T35900.3—2018 4.1.2 TRIzol:2℃~25℃保存。 4.1.3 氯仿:2℃~8℃预冷。 4.1.4 异丙醇:一20℃预冷。 4.1.5 DEPC水:见附录A中A.1。 4.1.6 75%乙醇:用新开启的无水乙醇和DEPC水配制,一20℃预冷 4.1.7 PBS(含牛血清白蛋白、青霉素和链霉素):配方见A.2。 4.1.8 引物和探针序列及反应液配方:见附录B。 4.1.9 阳性对照为灭活的H1和H3亚型动物流感病毒混合液,或H1和H3亚型流感病毒HA基因体 外转录cRNA混合液;阴性对照为已知流感病毒阴性的禽或猪组织悬液。 4.2 仪器设备及耗材 4.2.1 荧光PCR检测仪及配套反应管(板)。 4.2.2 高速台式冷冻离心机(最高离心速度不低于12000r/min)。 4.2.3台式离心机。 4.2.4振荡器。 4.2.5组织匀浆器。 4.2.6冰箱(2℃~8℃和-20℃两种)。 4.2.7微量移液器(5μL、10μL、100μL、1000μL)及配套吸头(无核酸酶)。 4.2.81.5mL离心管(无核酸酶)和5mL采样管。 5 实验室的标准化设置与生物安全管理 SAC 本方法的实验室设置与管理见GB/T19438.1—2004附录C;实验室生物安全管理见GB19489。 6样品的采集与前处理 6.1总则 采样过程中样本不得交叉污染,采样及样品前处理过程中应戴一次性手套。 6.2采样及处理工具 6.2.1采样专用商品化棉拭子、剪刀、镊子、研钵、5mL采样管、一次性采样袋。 6.2.2除棉拭子和采样袋外,上述取样工具应经121℃土2℃,15min高压灭菌并烘干或经160℃干烤 2 h。 6.3样品采集 6.3.1拭子样品 活动物采集拭子样品。根据动物种类可采集咽喉拭子、泄殖腔拭子(禽类)或鼻拭子(猪)。采集方 法如下: 取咽喉拭子时将拭子深人喉头及上颚裂来回刮2次~3次并旋转,取分泌液; 取泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便; 取鼻拭子时将拭子深人鼻腔来回刮2次~3次并旋转,取分泌物。 2 GB/T 35900.3—2018 6.3.2组织样品 病死动物采集肺脏或气管等组织。用无菌剪、镊采集待检组织,装入一次性采样袋或其他灭菌容 器,编号。 6.4样品贮运 样品采集后置保温箱中,加人预冷的冰袋,密封,24h内送实验室。 6.5样品处理 6.5.1拭子样品 样品在振荡器上充分混合后,将拭子中的液体挤出,3000r/min离心5min,吸取上清液1.0mL转 人无菌的1.5mL离心管中,编号备用。 6.5.2组织样品 用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0g于研钵或组织勾浆器中充分研磨,再加10.0mLPBS(含 牛血清白蛋白、青霉素和链霉素)混匀,3000r/min离心5min后,取1.0mL上清液转人无菌1.5mL 灭菌离心管中,编号备用。 6.6样品存放 采集或处理好的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h;若需长期保存,应放置一70℃冰箱, 但应避免反复冻融(冻融不超过3次)。 7操作方法 7.1样品核酸提取 7.1.1在样本制备区进行,采取TRIzol裂解法提取;也可采用其他等效的RNA提取方法。 7.1.2待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示,取n个灭菌1.5mL离心管,逐管编号。 7.1.3每管加入600μLTRIzol。 7.1.4每管对应编号分别加入200μL待检样品、阳性对照或阴性对照,混匀。 7.1.5每管加入200μL氯仿,充分颠倒混匀。于4℃、12000r/min离心15min。 7.1.6新取n个灭菌的1.5mL离心管,逐管编号,每管加入500μL异丙醇(一20℃预冷)。 混匀。 7.1.8于4℃、12000r/min离心15min,轻轻倒去上清,倒置于吸水纸上,沥干液体,不同样品应在吸 水纸不同地方沥干。 7.1.9每管加人600μL75%乙醇(一20℃预冷),颠倒洗涤。 7.1.10于4℃、12000r/min离心10min,轻轻倒去上清,倒置于吸水纸上,沥干液体,不同样品应在 吸水纸不同地方沥干。 7.1.114000r/min离心10s,将管壁上的残余液体甩到管底部,用微量移液器尽量将其吸干。注意一 份样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀一面。 7.1.12室温干燥3min。不宜过于干燥,以免RNA不溶。 7.1.13每管加人11μLDEPC水,轻轻混勾,溶解管壁上的RNA,2000r/min离心5s,获得RNA溶 3 GB/T35900.3—2018 液,冰浴保存备用(4℃保存不超过8h,若需长期保存应放置一70℃冰箱)。 7.2扩增试剂的准备与配制 7.2.1反应混合物配制区进行。 制反应液,充分混匀后分装,每个反应管40uL。转移反应管至样本制备区。 7.3加样 7.3.1在样本制备区进行。 7.3.2在上述7.2.2的反应管中分别加人7.1.13中制备的RNA溶液10μL,使每管总体积达到50uL, 记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后,瞬时离心。 7.4荧光RT-PCR反应 7.4.1在检测区进行。 7.4.2应使用能采集并区分FAM和HEX这两种不同荧光信号的多通道荧光PCR仪。 7.4.3将7.3.2中加样后的反应管放入荧光PCR检测仪内,编辑样品表后,选定FAM检测通道读取 感病毒核酸的检测结果,并选择BHQ1作为无荧光淬灭基团。反应参

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