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ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T35909—2018 猪肺炎支原体PCR检测方法 Detection of mycoplasma hyopneumoniae using PCR method 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35909—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:江苏省农业科学院。 本标准起草人:邵国青、冯志新、熊祺琰、刘茂军、张磊、王海燕、武昱孜、韦艳娜、刘蓓蓓、甘源、华利忠, 王佳、王丽。 1 GB/T 35909—2018 猪肺炎支原体PCR检测方法 1范围 本标准规定了猪肺炎支原体PCR检测的操作方法 本标准适用于实验室对猪临床样品(猪鼻拭子、肺组织和支气管肺泡灌洗液)、细菌培养物和动物产 品中猪肺炎支原体核酸的快速检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27401实验室质量控制规范 动物检疫 病死及病害动物无害化处理技术规范农医发[2017]25号 兽医实验室生物安全管理规范(中华人民共和国农业部公告第302号) 3术语和定义及缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 猪肺炎支原体 Mycoplasmahyopneumoniae;MHP 支原体科支原体属(Mycoplasma)成员,是猪支原体肺炎(MPS)的主要病原体。 注:猪支原体肺炎又称猪气喘病,是一种经呼吸道感染的慢性病,对养猪业造成严重危害。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) PBS 磷酸盐缓冲液(phosphate-bufferedsalinebuffer) TAE TAE电泳缓冲液(tris-acetate-ethylenediaminetetraacetic acidbuffer) TBETBE电泳缓冲液(tris-borate-ethylenediaminetetraacetic acid buffer) Taq酶TaqDNA聚合酶(Taq DNApolymerase) dNTPs 脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphates) DNAJ 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) CCU 颜色变化单位(color changeunit) MPS 猪支原体肺炎(mycoplasmalpneumoniaofswine) 1 GB/T35909—2018 4仪器设备 4.1 高速冷冻离心机。 4.2 核酸电泳仪。 4.3恒温水浴锅。 4.4凝胶成像系统。 5PCR扩增仪。 4.5 4.6 5水平电泳槽。 4.7 微量移液器(量程:0.5μL10μL;2μL20μL:20μL~200μL;100μL~1000μL)。 4.8 组织匀浆器。 5 试剂和材料 5.1引物 上游引物:5'-GAGCCTTCAAGCTTCACCAAGA-3 下游引物:5-TGTGTTAGTGACTTTTGCCACC-3' 5.2猪肺炎支原体阳性对照样品及阴性对照样品 以灭活前浓度为1X10°CCU/mL~1×10CCU/mL的猪肺炎支原体菌液培养物(由指定单位提 供),经PCR检测不含猪絮状支原体、猪滑液支原体和猪鼻支原体后作为阳性对照样品,以无菌双蒸水 作为阴性对照样品。 5.3 3试剂 5.3.1 除另有规定外,所用生化试剂均为分析纯,试验用水符合GB/T6682的要求。 5.3.2 Taq 酶。 5.3.3 PCR反应缓冲液(与Taq酶匹配)。 5.3.4 氯化镁(MgCl²,25mmol/L)。 5.3.5 dNTPs(dATP,dCTP,dGTP,dTTP,各 2.5 mmol/L)。 5.3.6 酚/三氯甲烷/异戊醇(体积比25:24:1)。 5.3.7 三氯甲烷。 5.3.8 异丙醇(一20℃预冷)。 5.3.9 琼脂糖。 5.3.10 DNA相对分子质量标准MarkerDL2000。 5.3.11 0.01mol/LPBS液(pH7.2~pH7.4)(配制方法见附录A)。 5.3.12 DNA提取液(配制方法见附录A)。 5.3.13 75%乙醇(配制方法见附录A)。 5.3.14 TE溶液(pH8.0)(配制方法见附录A)。 5.3.15 电泳缓冲液(1XTBE或1XTAE)(配制方法见附录A)。 5.3.16 溴化乙锭溶液(10mg/mL)(配制方法见附录A)。 5.3.17 上样缓冲液(配制方法见附录A)。 2 GB/T35909—2018 6操作程序 6.1# 样品采集、运输、处理和检测的生物安全要求 有关生物安全和防止交叉污染的措施见附录B。 6.2样品采集和运输 6.2.1新鲜肺组织样品采集和运输 剖检未腐败病死猪或发病猪,采集具有特征病变与正常组织连接处的肺组织0.5g~1.0g,置于无 菌密封袋或密封容器中,于2℃~8℃下24h内完成运送工作。如样品不能被及时送到实验室,应置 于一20℃以下保存。 6.2.2支气管肺泡灌洗液采集和运输 采集新鲜解部的未破损的猪肺脏,气管注入50mL~~100mL灭菌的0.01mol/LPBS(pH7.2~ pH7.4)溶液,轻探肺脏3min~5min,转移5mL~10mL灌洗液至无菌容器中,运输与保存方法同 6.2.1。 6.2.3鼻拭子采集和运输 采样人员将猪保定后,用棉拭子轻轻插人鼻腔,稍作拐弯,绕过骨状瓣膜,与鼻中隔平行方向插入约 PBS溶液的灭菌离心管中,运输与保存方法同6.2.1。 6.3样品处理与DNA提取 6.3.1肺组织的处理与DNA提取 取0.5g~1.0g肺组织样品,加入5mL0.01mol/LPBS溶液后,充分匀浆,制成0.1g/mL~0.2g/ml 500μL,振荡混匀,12000r/min离心5min,吸取上清液加人等体积的三氯甲烷,振荡混匀,12000r/min 离心5min,吸取500μL上清液与400μL的异丙醇充分混合,12000r/min离心5min,75%乙醇洗涤 沉淀一次,12000r/min离心5min,弃上清,沉淀干燥后溶于30μLTE溶液中,即可用于检测或保存 于-20℃。 6.3.2支气管肺泡灌洗液的处理与DNA提取 SZG 取5mL~10mL支气管肺泡灌洗液,12000r/min离心20min,弃去上清,沉淀用200μL 0.01mol/LPBS溶液重悬后,加人750μLDNA提取液提取DNA,方法同6.3.1。 也可使用其他经验证的DNA提取方法或等效的商品化DNA提取试剂盒,按照其使用说明操作。 6.3.3鼻拭子样品的处理与DNA提取 采用水煮法提取待检猪鼻拭子样品DNA。将浸有鼻拭子的离心管振荡5s,2℃~8℃放置2h,用 3 GB/T35909—2018 6.3.4培养物和阳性对照样品的处理与DNA提取 20min,弃去上清。其DNA提取的操作方法同6.3.3。 6.4PCR反应 6.4.1PCR反应体系 10XPCR反应缓冲液2.5μL、dNTPs(10mmol/L)2μL、氯化镁(25mmol/L)2μL、引物(10μmol/L) 各0.5μL、TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5μL、模板DNA2μL~5μL,用灭菌的双蒸水补足反应体积至 25μL。 也可使用等效商品化PCR反应预混液, 6.4.2PCR反应程序 95℃预变性12min后进人PCR循环;94℃变性20s,60℃退火30s,72℃延伸40s,进行30个 循环;最后72℃延伸7min;2℃~8℃保存反应产物。 6.4.3PCR产物电泳 PCR扩增产物与上样缓冲液按5:1比例混合,加样于已制备好的1%琼脂糖凝胶中(见附录A), 同时分别加MarkerDL2000(0bp~2000bp)、阴性对照和阳性对照,100V~~120V恒压电泳20min~ 40min,凝胶成像系统观察并记录结果 6.5 结果判定 6.5.1试验成立判定 若阳性对照样品出现649bp的目标扩增条带,同时阴性对照样品无目标扩增条带,则试验成立(参 见C.1)。否则试验不成立。 6.5.2检测结果判定 检样品未出现649bp目的条带,则判定为猪肺炎支原体核酸阴性; 若进一步验证,可对PCR扩增产物进行测序,其目标序列参见C.2。 4 GB/T359092018 附录A (规范性附录) 溶液的配制 A.1 0.01mol/L PBS溶液(pH7.2~pH 7.4) 准确称量下面各试剂,加人到800mL蒸馏水中溶解,调节溶液的pH至7.2~7.4,加水定容至1L。 分装后在121℃灭菌15min~20min,或过滤除菌,保存于室温 8.00 g 氯化钠(NaCI) 氯化钾(KCI) 0.20 g 磷酸二氢钾(KH,PO) 0.24 g 磷酸氢二钠(NazHPO,·12H,O) 3.65 g 蒸馏水 加至1000mL A.1电泳缓冲液的配制(1×TAE或1×TBE A.1.10.5mol/LEDTA(pH8.0)的配制 称取NaEDTA·2H2O18.61g,用80mL蒸留水

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