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ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 35911—2018 伪狂犬病病毒荧光PCR检测方法 Real-time PCR method for detection of pseudorabies virus 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35911—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中国农业科学院上海兽医研究所、中华 人民共和国深圳出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、湖南圣湘生物科技有限公司。 本标准主要起草人:张强、童光志、李健、熊炜、赵和平、李树清、王艳、李国新、杨忠苹、花群义、林颖峰、 王巧全、蔡开妹、喻正军、吴绍强、林祥梅。 1 GB/T 35911—2018 伪狂犬病病毒荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了伪狂犬病病毒荧光PCR检测的操作方法 本标准适用于伪狂犬病病毒核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T25172猪常温精液生产与保存技术规范 3 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 荧光PCR荧光聚合酶链式反应(real-timepolymerasechainreaction) Ct值每个反应管内的荧光信号量达到设定的值时所经历的循环数(cyclethreshold) DNA脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) Taq 酶 Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase) TE缓冲液 Tris-EDTA缓冲液(Tris-EDTAbuffer) PRV 伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus) 4 仪器 4.1 荧光PCR检测仪。 4.2 高速台式冷冻离心机:可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上。 4.3 组织研磨器或者研钵。 4.4 普通冰箱:2℃~8℃。 4.5 普通冰柜:一20℃以下 超低温冰箱:可控温至一70℃以下。 4.7 配备与移液器匹配的吸头 4.8 高压灭菌锅。 5 耗材 5.11.5mL离心管 5.20.2mLPCR薄壁管或八联管。 1 GB/T35911—2018 6试剂 6.1 除非另有说明,在检测中使用的试剂均为分析纯,实验室用水应符合GB/T6682的要求。 6.2DNAzol,商品化DNA抽提试剂,于2℃~8℃保存。 6.3无水乙醇,一20℃预冷 6.58mmol/LNaOH溶液,配制见附录A。 6.6PBS缓冲液,配制见附录A。 6.7Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液:Taq酶浓度为5U/uL,Taq酶反应缓冲液中Mg+浓度 为15mmol/L。 6.8dNTPs:含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol/L,一20℃保存,避免反复冻融 6.9引物和TaqMan探针,其序列见附录B。 6.10伪狂犬病病毒阳性对照样品和阴性对照样品:阳性对照使用灭活疫苗或组织培养灭活毒, 一20℃保存备用;阴性对照可采用健康猪的组织材料。 6.11内参照质粒:带有人β-珠蛋白基因的质粒。 7样品采集和处理 7.1买 采样工具 7.1.1手术刀、剪刀、镊子,经160℃干热灭菌2h。 7.1.2 一次性无菌采样拭子。 7.1.3组织研磨器或者研钵,经160℃干热灭菌2h。 7.1.4真空采血管。 7.2样品采集 7.2.1血液样品采集:用无菌注射器采集血液,注含1/104%EDTA溶液的无菌容器中,充分混匀, 编号备用 7.2.2精液样品采集:按照GB/T25172的方法采集和保存精液。 7.2.3鼻子采集:用棉子取受检动物鼻腔分泌物,置于2mLPBS缓冲液中备用。 7.2.4组织样品采集:取大脑海马背侧皮层、中脑、脑桥、三叉神经节、扁桃体、肺脏、淋巴结等组织,置 于无菌离心管内,编号备用。 7.2.5细胞培养物:细胞培养物反复冻融三次,第3次解冻后,将细胞培养物置于1.5mL无DNA酶 的灭菌离心管内,编号备用。 7.3 3样品保存和运输 一20℃土5℃下应不超过3个月,一70℃以下可长期保存。样品运送采用低温保存进行运输,并在规 定温度下的保存期内送达。 7.4样品处理 7.4.1血液和精液样品无需进行前处理,直接用于核酸提取。 2 GB/T 35911—2018 5min,取上清后用于后续的核酸提取。 7.4.3组织样品:取1g解冻的组织,剪碎,加人2mLPBS缓冲液进行研磨,制备组织匀浆,8000r/min离 心5min,取上清用于后续的核酸提取。 7.4.4细胞培养物:4.000r/min,4℃离心10min,取上清用于后续的核酸提取。 8荧光PCR操作程序 8.1DNA抽提 8.1.1在核酸提取区操作。DNA抽提使用DNAzol手工提取,也可以使用等效的商品化试剂盒提取。 8.1.2取n个灭菌的1.5mL离心管,其中n为待检样品数十阳性对照十阴性对照,对每个离心管进 行编号。 8.1.3每管先加人800μLDNAzol,再分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各200μL,颠倒10次混 匀,4℃或室温10000r/min离心10min。 8.1.4取900μL上清,置新的1.5mL灭菌离心管中,加人500μL无水乙醇,混匀,室温放置3min; 4℃或室温10000r/min离心5min。 8.1.5弃上清,沿管壁缓缓加入0.8mL~1mL75%乙醇,颠倒3次~6次混勺,4℃10000r/min离心 5min。反复洗涤两次后,将离心管倒扣于吸水纸上,自然晾干或用移液器移去残液 8.1.6用30μuL8mmol/LNaOH溶液溶解沉淀,DNA在2℃~8℃冰箱可保存两个月,一20℃冰柜 可稳定保存两年。 8.2荧光PCR检测 8.2.1反应体系的配制 在试剂配制区进行。设实时荧光PCR反应管数为n,n为待检样品数十阳性管数十阴性管数,每 个反应的体系见附录C,为了避免移液器取样损失,建议按n十1个反应进行配制。配制反应液在冰盒 中进行。 8.2.2反应液的分装 将8.2.1中配制的荧光PCR反应液充分混匀,按照每管39.8L分装于0.2mL透明PCR管内,将 PCR管置于96孔板上,按顺序加样并做好标识,转移至核酸提取区。 8.2.3加样 在核酸提取区进行。在每个PCR反应管内加人0.2μL的内参照质粒,并分别加人8.1制备的核酸 10μLDNA溶液,盖上盖子,500r/min1000r/min离心30s。转移至检测区。 8.2.4上机检测 8.2.4.1荧光通道设置 在检测区进行。将8.2.3中离心后的PCR管放人荧光PCR检测仪内,设置探针:5°选择FAM、 HEX和ROX三个荧光通道,3均选择无(None)荧光 8.2.4.2循环条件设置与检测 第一阶段,预反应50℃/2min; 第二阶段,预变性95℃/2min; 3 GB/T35911—2018 第三阶段,变性95℃/15s,退火、延伸、荧光采集60℃/30s,40个循环; 第四阶段,冷却25℃/10s。 检测结束后,保存结果,根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。 9结果判定 9.1 闵值设定 國值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以國值线刚好超过正常阴性样品扩增的最高点为准 9.2质量控制 9.2.1PRV阴性对照:FAM通道无报告Ct值或无典型的S型扩增曲线,HEX通道无报告Ct值或无 典型的S型扩增曲线,ROX通道Ct值≤36且扩增曲线为典型的S型。 的扩增曲线均为典型的S型。 9.2.3以上要求需在同一次实验中同时满足,否则,本次实验无效,需重新进行。 9.3结果描述及判定 9.3.1被检样本检测结果中FAM通道Ct值≤38,HEX通道Ct值<38,且扩增曲线均为典型的S曲 线,报告为PRV核酸阳性;38<Ct值≤40,判定为可疑,可疑样品须重复检测。如重复后仍然38<Ct 值≤40,且扩增曲线均为典型的S曲线,报告为PRV核酸阳性 Ct值或者无典型的S型扩增曲线,报告为PRVgE缺失株核酸阳性。 9.3.3被检样本检测结果中FAM通道和HEX通道均无Ct值或无典型的S型扩增曲线,同时ROX 通道Ct值<36且扩增曲线为典型的S曲线,则该样本超过本方法检测灵敏度范围,报告为PRV核酸 阴性。 9.3.4被检样本检测结果中FAM通道和HEX通道均无Ct值或无典型的S型扩增曲线,同时ROX 通道Ct值>36,则该样本的检测结果无效,应查找并排除原因,并对此样本进行重复实验。 4 GB/T 35911—2018 附录A (规范性附录) 溶液配制 A.18 mmol/L NaOH溶液 称量0.32gNaOH,溶解到1000mL去离子水中,混匀,分装,常温保存。 A.2 磷酸盐缓冲液(0.01mol/LPBS.pH7.4) 用800mL蒸馏水溶解8gNaCl,0.2gKCl,1.44gNa2HPO,和0.24gKH2PO。用HCI调节溶 液的pH至7.4,加水至1L。分装后经121℃、15min高压灭菌后备用。 5

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