ICS 07.080 CCS A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T 40226—2021 高通量测序法 环境微生物宏基因组检测 Detection of environmental microbial metagenomeHigh throughput sequencing 2021-05-21发布 2021-12-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T 40226—2021 目 次 前言 1 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义 4 缩略语 5 原理 6 试验条件 7 试剂 仪器设备 样品 10 试验步骤 11 试验报告 12 质量控制· 附录A（规范性） 粪便样品采集、保存、运输方法 附录B（规范性） 土壤样品采集、保存、运输方法 附录C（规范性） 水体样品采集、保存、运输方法 附录D（资料性） 样品信息单 附录E（资料性） DNA样品的完整性图谱和质量级别分类 10 附录F（资料性） 参考数据库 11 参考文献 12 GB/T40226—2021 前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。 本文件起草单位：深圳华大生命科学研究院、深圳华大基因科技有限公司、深圳市生命科技产学研 资联盟、中国测试技术研究院生物研究所、深圳华大临床检验中心。 本文件主要起草人：陈冰、肖亮、钟焕姿、李俊桦、李倩一、贾慧、姜华艳、周李华、唐美芳、吴昊、 李陶莎、周媛、钟宏彬。 GB/T 40226—2021 环境微生物宏基因组检测高通量测序法 1范围 本文件描述了采用高通量测序技术进行环境微生物宏基因组检测的术语和定义、原理、试验条件、 试剂、仪器设备、样品、试验步骤、试验报告和质量控制要求。 本文件适用于运用高通量测序法进行环境微生物宏基因组的检测。 2规范性引用文件 2 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。 GB/T 6682 分析试验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T35537—2017高通量基因测序结果评价要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 环境 environment 相对某项中心事物的周围世界。 注：在本文件中特指人体（动物）环境与自然环境。人体（动物）环境包括但不限于口腔、皮肤、生殖道、肠道等：自然 环境包括但不限于空气、水体、土壤、沉积物等 3.2 SAG 相对丰度 relative abundance 某一特定种类微生物在环境微生物群落中所占的相对比例。 注：通常以百分比表示。 3.3 微生物宏基因组 microbial metagenome 以特定环境中整个微生物群落作为研究对象，不分离培养，直接提取得到的所有微生物基因 组 DNA。 注：可用于分析其遗传信息、物种分类、系统进化、基因功能及代谢网络等。 3.4 碱基识别质量 quality of base calling 评价碱基准确识别的概率。 注：简称为Q，通常以数值表示。碱基识别质量值与碱基识别错误率负相关，二者遵循对数函数关系。碱基识别质 量值越高，错误率越低。 1 GB/T40226—2021 3.5 Q20 测序数据中，碱基识别质量值为20的碱基识别准确率为99%，或错误率为1%。 3.6 Q30 测序数据中，碱基识别质量值为30的碱基识别准确率为99.9%，或错误率为0.1% 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) ID：识别码（identifier） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） RNA：核糖核酸(ribonucleic acid) 5 原理 运用高通量测序技术对环境样品中微生物基因组DNA进行测序，再将测序结果与现有数据库中 序列进行比对，从而检测样品中所含微生物种类和相对丰度 6 试验条件 SAG 6.1实验室设施和设备要求应符合GB19489的规定。 6.2 2实验室用水应符合GB/T6682的规定。 6.3 3实验室应做到防止污染，应根据不同工作内容划分独立区域，并有明显标志，如试剂储备和准备 区、样品制备区、扩增区等，各区域间应避免交叉污染 7试剂 7.1DNA提取试剂 7.2 2PCR产物纯化试剂。 7.3 3文库制备试剂。 7.4 4高通量测序试剂。 8 仪器设备 8.1 高通量测序仪。 8.2 PCR仪。 8.3 3冷冻离心机：最大离心力12000g以上。 8.4 微量移液器。 8.5 紫外分光光度计。 8.6 荧光定量仪。 2 GB/T40226—2021 8.7电泳仪。 8.8 凝胶成像系统 8.9水浴锅。 8.10低温冰箱：-20℃和一80℃。 9样品 9.1样品采集、保存和运输 9.1.1样品采集应经过伦理审查和生物安全评价审查 9.1.2应即刻采样，减少样品暴露于空气中的时间，同时应避免样品被其他物质污染 粪便样品采集、保存和运输方法按附录A，土壤样品采集、保存和运输方法按附录B，水体样品采集、保 存和运输方法按附录C执行。 9.2样品接收与处理 应核对样品编号，记录样品信息，检查样品状态，避免密封不严导致泄漏或污染等，否则该样品应废 弃，重新采样。应记录样品信息（见附录D），以保证样品的可追溯性。 10试验步骤 10.1DNA提取 10.1.1原理 将环境样品悬浮于裂解缓冲液中，通过抽提等步骤提取微生物基因组DNA，充分去除样品中的蛋 白质、脂类、多糖、RNA等杂质。宜选用手工提取方法或相应DNA提取试剂盒。 10.1.2DNA样品浓度和完整性检测 环境样品提取微生物基因组DNA后，应使用荧光定量仪检测DNA样品浓度，使用琼脂糖凝胶电 泳法检测DNA样品完整性。宜综合DNA样品浓度及完整性，判断DNA样品质量级别，判断依据见 附录E。 10.2文库构建与高通量测序 10.2.1应使用合适的DNA样品和文库构建试剂进行文库构建。进行文库构建的DNA样品类别选择 标准按表1。 表1进行文库构建的DNA样品类别选择标准 DNA样品类别 是否满足文库构建 A类 满足文库构建要求，DNA总量≥1.0ug B类 满足文库构建要求，DNA总量≥0.5μg，且<1.0μg 不完全满足文库构建要求，可以尝试进行该步骤，但不保证测序质量 C类 建议重新采样，重新提取样品微生物基因组DNA 3 GB/T40226—2021 10.2.2 2应使用合适的文库和高通量测序试剂进行高通量测序。高通量测序按GB/T35537一2017的 附录 A进行。 10.3数据处理 10.3.1 数据质控 10.3.1.1 质控步骤 样品经过高通量测序得到的原始数据，应进行质量控制，去除含接头或低质量的序列、外源或宿主 基因组序列，再进行后续生物信息学分析。 10.3.1.2碱基识别质量值要求 测序完成后，应进行Q20、Q30的统计和评估。每个DNA样品可用数据对应的碱基识别质量值应 符合如下要求： 一一大于Q20的碱基比例≥90%； 一大于Q30的碱基比例≥80%。 10.3.1.3可用数据量要求 可用测序数据量应达到声明目标物种可从样品中检测到的最小测序数据量。每个样品测序生成的 可用高质量序列数目应大于1×10°条。 注：序列数目为单端测序序列条数，或双端测序序列对数。 10.3.2物种注释 数据质控后对样品数据进行物种注释。除特殊方法外，对于已知物种，宜使用数据库中序列相似度 95%以上，覆盖度90%以上的物种信息进行注释。数据库见附录F。 10.3.3序列拼接与组装 数据质控后对样品数据可进行序列拼接与组装。使用组装软件将序列进行拼接，得到更长的叠连 群，将这些叠连群片段聚集起来，与参考数据库进行比对，得到新的参考基因集。数据库见附录F。 10.3.4微生物物种相对丰度计算 数据质控后对样品数据进行物种相对丰度计算，应对所使用的相对丰度计算方法进行记录。除特 殊方法外，宜将可用高质量测序数据比对到组装好的参考基因集或合适的数据库上，按相似度95%以 上，覆盖度90%以上进行统计，得到基因水平上的相对丰度分布情况，再将注释到同一物种分类水平的 基因序列相对丰度进行叠加，得到该物种的相对丰度结果 11试验报告 试验报告应包含环境样品中微生物群落的物种组成及各成分相对丰度，可增加个性化功能分析部 分，并应至少包括下列内容： a）检测机构名称、联系方式和地址、检测员、样品接收时间、样品检测时间及报告时间； b）测序平台与测序策略； 4