ICS 19.020 G 76 中华人民共和国国家标准 GB/T39304—2020 再生水生物毒性检测的样品前处理 通用技术规范 General technical specification for sample pre-treatment of biological toxicity detection in reclaimed water 2021-10-01实施 2020-11-19 发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T39304—2020 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国石油和化学工业联合会提出 本标准由全国化学标准化技术委员会（SAC/TC63）归口。 本标准起草单位：南京大学、南京大学宜兴环保研究院、江苏中宜金大环保产业技术研究院有限公 司、中海油天津化工研究设计院有限公司、蓝保（厦门）水处理科技有限公司、东莞理工学院、石家庄给源 环保科技有限公司、珠海京工检测技术有限公司、江苏科标医学检测有限公司。 本标准主要起草人：任洪强、吴兵、张徐祥、耿金菊、吕奋勇、牛军峰、李永广、王磊、王庆、薛银刚、 尹金宝、李琳。 GB/T39304—2020 再生水生物毒性检测的样品前处理 通用技术规范 1范围 本标准规定了再生水中污染物生物毒性检测时样品前处理的通用技术要求。 本标准适用于再生水生物毒性检测前样品采集、制备和质量控制 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 HJ/T372水质自动采样器技术要求及检测方法 HJ493水质采样样品的保存和管理技术规定 HJ494水质采样技术指导 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 再生水 reclaimed water,recycle water 再生水系指生活污水或工业废水经适当再生工艺处理后，达到一定的水质标准，满足某种使用功能 要求，可以进行有益使用的水。 注：改写GB/T19923—2005，定义3.2。 3.2 生物毒性检测biologicaltoxicitydetection 利用生物的反应测定一种或多种污染物或环境因素单独或联合存在时，所导致的影响或危害 注：所利用的生物反应包括分子、细胞、组织、器官、个体、种群、群落-生态系统各级水平上的反应。 3.3 样品前处理 samplepre-treatment 根据检测方法的要求，将样品处理到符合后续测试要求的所有样品制备过程。 注：包括但不限于样品解冻、混勾、可溶性和颗粒状组分的分离、pH调节、预浓缩等步骤。 3.4 sub-sample 子样本 从样品中取出具有代表性的部分样品。 4样品 4.1样品采集 4.1.1样品采集应符合HJ494的规定 1 GB/T39304—2020 4.1.2采样点应设在再生水处理设施的出水口，或根据试验需求设在再生水管网末端或者再生水使用点。 4.1.3采样设备和样品容器应保持洁净，使用前用待采样品冲洗3次。 进行采样。自动采样器规格应符合HJ/T372的规定。 4.1.5样品应完全装满样品容器。样品容器材质和规格应依据样品的性质、生物毒性检测所需的体积 以及保存和储存样品的方式确定。样品容器宜选用瓶盖带聚四氟乙烯衬垫的棕色、螺口、大口玻璃瓶， 也可根据检测需求采用聚丙烯、聚乙烯容器。 4.1.6样品容器上应牢固粘贴标识或标签，采集时记录样品信息，注明编号、采样日期、采样地点和采 样者姓名等信息。根据水样的生物毒性测定具体要求，可提供其他必要的样品信息并注明。 4.1.7子样本的采集：在现场取样后、实验室进一步处理前或样品解冻后从样品中取出部分样品从而 获得子样本；采集时间和采样量取决于具体毒性检测要求；采样前应彻底混合样品，同时在采样过程中 应的标识或标签，记录与原样本标签一样的完整信息，同时增加记录子样本采集时间及采样方式。 4.2样品保存、运输及购藏 4.2.1样品保存、运输及贮藏应符合HJ493的规定。 4.2.2采样后，样品应立即冷藏避光保存，冷藏温度宜为2℃～8℃。 4.2.3运输过程中应防止样品容器霜冻、破裂、温度升高或外部污染。 4.2.4样品毒性测试应在72h内完成。样品不能在72h内完成测试时，应尽快分装样品并于一20℃ 品需求量更大的测试，样品应分装于多个容器，每个容器不超过10L 4.2.5如有特定要求，应针对不同样品类型和生物毒性检测要求分别确定贮藏保存方法和周期。 5样品前处理 5.1一般要求 5.1.1样品前处理过程中所用试剂和水，除非另有规定，应使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的 三级水。 5.1.2样品前处理过程中所用仪器设备，与样品接触部分的材质应不易浸出化学物质且在化学和生物 方面应具有惰性，宜采用玻璃、聚四氟乙烯等材质。 5.1.3根据生物毒性检测的具体要求，可选择但不限于样品前处理的下列过程，包括样品的解冻与混 匀、可溶性和颗粒组分的分离、pH调节、预浓缩等步骤。 5.2解冻与混匀 5.2.1冷冻保存的样品应在温度不大于25℃的水浴中完全解冻，也可在2℃～8℃下避光放置过夜直 到完全解冻。解冻的样品不应再次冷冻。 5.2.2解冻同时缓缓搅拌或摇动使样品混勾，保证可溶性组分和颗粒组分的均勾分布，避免挥发性成 分的损失。 5.2.3试验报告中应详细记录样品的解冻与混匀过程， 5.3可溶性和颗粒状组分的分离 5.3.1对于含有大量颗粒物的样品，放置30min120min后，用移液管直接移取上清液。也可采用孔 径大于50μm的滤膜进行粗过滤，或使用离心机于6000r/min下离心10min。 5.3.2对于富含细菌的样品，可采用膜过滤（0.22um）等方法进行灭菌处理。 5.3.3样品过滤时应满足以下要求： 2 GB/T39304—2020 a) 滤膜材料应由惰性材料制成，如玻璃纤维膜； b) 使用前用水冲洗过滤器； c） 采用待测样品预处理过滤器； d) 在一定压力或真空下进行过滤； e) 样品过滤处理时，应进行质量控制，测定过滤器的回收率； f） 样品预浓缩前，必须进行过滤。 5.3.4试验报告中应详细记录样品的可溶性组分和颗粒状组分的分离方法及过程。 5.4pH调节 5.4.1样品pH值应为6.0~9.0。 5.4.2pH值超过测试生物的耐受极限（发光菌pH值为6~9，大型蚤pH值为6.5~8.5，鱼类pH值为 69）时，样品应调整至pH值为7.0土0.2。 5.4.3调节pH值所需的酸或碱的浓度应使得体积变化尽可能小，酸或碱不应与样品中的成分发生沉 淀或络合反应，也不应对生物测试造成影响。通常推荐使用盐酸或氢氧化钠溶液 5.5预浓缩 5.5.1分析样品中低浓度污染物毒性，或检测特定的体外生物毒性时，应对样品进行预浓缩，即对样品 中的污染物进行选择性富集。 5.5.2应根据生物毒性检测的要求选择预浓缩的具体方法，尽量去除样品的基质组分（如盐以及可能 掩盖样品毒性的营养物）。 5.5.3预浓缩应考虑以下因素： a） 选择预浓缩方法前，应对预浓缩方法对水样毒性检测结果的影响进行评估： b) 充分考虑预浓缩的选择性程度和浓缩系数，不可将预浓缩样品的急性毒性测试的效应推断为 原始样品的慢性影响； c) 有机污染物组分宜采用液液萃取、固相萃取等方法； d) 蒸发、冷冻干燥和萃取应考虑挥发性物质的损失的影响； e) 蒸发和冷冻干燥应考虑离子强度和渗透压提高的影响； 超滤应考虑穿透膜的小分子的损失带来的影响； 5.5.4试验报告中应详细记录样品的预浓缩方法及过程。 样品前处理示例 儿种常见的生物毒性检测方法的样品前处理示例参见附录A，分别为发光菌急性毒性检测试验、水 生生物毒性检测试验、哺乳动物毒性检测试验和细胞毒性检测试验的样品采集后的实验室前处理过程。 7质量控制 7.1设置现场空白样本，作为样本对采样过程进行分析，以识别与取样容器污染和取样过程有关的误差。 7.2设置阳性对照，将生物毒性检测中会产生阳性结果的对照物加人空白样本中，作为样本对前处理 过程进行分析。 7.3设置平行样 7.4当需要在现场或实验室过滤样品时，应使用与实验室样品相同的过滤程序处理现场空白和阳性对 照样品。 3 GB/T39304—2020 附录A （资料性附录） 样品前处理示例 A.1发光菌急性毒性检测试验前处理 A,1.1概述 本步骤处理后的样品适用于发光菌急性毒性检测试验，为减少样品中悬浮颗粒对发光菌急性毒性 检测结果的干扰，样品需过滤处理后再进行稀释。 A.1.2 试剂或材料 A,1.2.1 氯化钠。 A.1.2.2 玻璃纤维膜：5μm。 A.1.3 3仪器设备 过滤装置：带有真空泵的砂芯过滤装置。 A.1.4试验步骤 A.1.4.1 样品过滤：采用玻璃纤维膜对待测样品进行过滤。 A.1.4.2样品稀释：根据试验需求，用水稀释样品配成不同浓度的试验溶液，在定容前按每100mL样 品加入3g氯化钠的浓度添加氯化钠 A,2水生生物毒性检测试验前处理 A.2.1概述 本步骤处理后的样品适用于多种水生生物毒性检测试验，包括：大型蚤、鱼类、大型甲壳类等水生生 物的急性毒性、慢性毒性等毒性检测试验，为减少样品中悬浮颗粒对水生生物毒性检测结果的干扰，样 品需过滤处理后再进行稀释、温度及溶解氧的调节 A.2.2试剂或材料 A.2.2.1 盐酸溶液：0.1mol/L。 A.2.2.2 氢氧化钠溶液：0.1mol/L。 A.2.2.3 氯化钙溶液：称取11.76g氯化钙（CaClz·2H,O）溶于水，用水稀释至1L。 A.2.2.4 硫酸镁溶液：称取4.93g硫酸镁（MgSO·7H,O）溶于水，用水稀释至1L。 A.2.2.5 碳酸氢钠溶液：称取2.59g碳酸氢钠（NaHCO：）溶于水，用水稀释至1L。 A.2.2.6 氯化钾溶液：称取0.23g氯化钾（KCI)溶于水，用水稀释至1L。 A.2.2.7 玻璃纤维膜：5μm。 A.2.3 仪器设备 A.2.3.1 曝气泵。 4 GB/T39304—2020 A.2.3.2过滤装置：带有真空泵的砂芯过滤装置。 A.2.3.3溶氧仪。 A.2.4试验步骤 A.2.4.1样品过滤：采用玻璃纤维膜对待测样品进行过滤 A.2.4.2标准稀释水的制备：氯化钙溶液、硫酸镁溶液、碳酸氢钠溶液及氯化钾溶液分别移取25mL加 以混合，并用水稀释至1L，混匀后曝气，同时用溶氧仪测定，直至溶解氧浓度达到空气饱和值后，再用 氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节溶液pH值为7.0士0.2。 A.2.4.3样品稀释：根据试验需求，用标准稀释水（A.2.4.2）稀释样品配成不同浓度的试验溶液进行毒 性检测试验 A.2.4.