ICS 07.080 A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T39101—2020 多肽抗菌性测定 抑菌圈法 Determination of antimicrobial activity for polypeptidesInhibition zone method 2020-09-29发布 2021-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T39101—2020 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387)提出并归口。 本标准起草单位：北京工商大学、河北科技大学、深圳市计量质量检测研究院、河北农业大学、北京 萨姆伯科技有限公司、武汉明了生物科技有限公司、浙江东杰生物科技有限责任公司、市场监督管理总 局食品审评中心、中国测试技术研究院生物研究所 本标准主要起草人：贾英民、马爱进、王志新、田益玲、郝帅、彭海、周李华、杨志坚、郑燕燕、郑刚、 陈晶、姜雨、杨国武 1 GB/T 39101—2020 多肽抗菌性测定 抑菌圈法 1范围 本标准规定了多肽抗菌性的抑菌圈测定方法。 本标准适用于多肽抗细菌性能和抗丝状真菌性能的测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB4789.2食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 多肽polypeptides 介于氨基酸和蛋白质之间，由2个或2个以上氨基酸通过肽键连接形成的一类化合物。 3.2 抑菌圈inhibitionzone 固体培养基表面与试样接触边界处无菌繁殖的环带区域。 3.3 抗菌性 antimicrobial activity 抑制微生物繁殖的能力，以抑菌效价U值（AU)来表示。 4. 原理 利用多肽在固体平板中与测试指示菌接触后，使其周围的菌株生长受到抑制，形成无菌繁殖区域 根据测试菌在固体平板表面表现出的抑菌圈直径，计算抑菌效价U值来判定活性。 试剂或材料 除非另有说明，本方法所用的试剂均为分析纯，实验用水为GB/T6682规定的一级水。 5.1 生理盐水 0.85%生理盐水：称取8.5g氯化钠于容量瓶中，用一级水溶解并定容至1000mL。121℃土1℃ 高压蒸汽灭菌20min。 1 GB/T39101—2020 5.2培养基 营养肉汤培养基（NB）、营养琼脂培养基（NA）、马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（PDA），配制参见附 录A。 5.3指示菌标准菌株 革兰氏阳性细菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）CICC10473（CGMCC1.8721、 ATCC29213），藤黄微球菌（Micrococcusluteus)CICC10269（CGMCC1.3749、ATCC10240），蜡样芽孢 杆菌(Bacilluscereus)CICC10277(CICC10468ATCC11778)。 革兰氏阴性细菌：大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）CICC10305（CICC23657、CGMCC1.2385、 (Pseudomonas aeruginosa)CICC10351(CICC23694,CGMCC1.2421,ATCC 9027)。 丝状真菌：黑曲霉（Aspergillusniger)CICC2463（CGMCC3.5487、CICC40372、ATCC16404），产 黄青霉（Penicillium chrysogenum)CICC40654（CGMCC3.7894、ATCC10106)，桔青霉（Penicillium citrinum)CICC2478(ATCC.9849)。 6仪器设备 6.1恒温培养箱：温度精度1℃。 6.2电子天平：感量为0.0001g和0.01g。 6.3分光光度计：波长范围为190nm900nm。 6.4游标卡尺或抑菌圈测量仪：精度0.02mm~0.1mm。 6.5，血球计数板：16格×25格或25格×16格。 6.6玻璃平皿：直径为90mm，底部平整 6.7 不锈钢牛津杯：内径6.0mm±0.1mm、外径7.8mm土0.1mm高10.0mm±0.1mm。 7试验步骤 7.1 抗细菌性能测定 7.1.1样品制备 称取多肽样品10.0mg，水溶性好的样品采用无菌缓冲液溶解与定容，水溶性差的样品先溶于无水 乙醇再用无菌缓冲液定容至1.0mL，使其浓度为10.0mg/mL，作为储备液，4℃~6℃冰箱中保存，应 液，浓度的选择应使抑菌圈直径8.00mm~25.00mm，且线性方程R≥0.9900。 7.1.2指示菌悬液制备 7.1.2.1菌种活化 将指示菌接种于5.0mLNB培养基的试管，36℃土1℃、200r/min士1r/min培养18h~24h进 行第一次传代培养；取第一代培养液接种于5.0mLNB培养基的试管，36℃士1℃、200r/min土1r/min培 培养基的锥形瓶，36℃土1℃、200r/min土1r/min培养至指示菌的稳定期，作为第三代培养液。 2 GB/T 39101—2020 7.1.2.2菌悬液制备 预先按照GB4789.2进行指示菌的菌落计数，建立菌落数与吸光度值（OD600）的对应关系；将第三 代培养液调整至合适的吸光度值，使其菌悬液浓度为1×10"CFU/mL~5×10*CFU/mL。 7.1.3检测平板制备 将配制的NA培养基加热溶解，冷却至45℃50℃，将制备的指示菌菌悬液按照1%的添加量加 后备用。 7.1.4测定 在含有指示菌的检测平板中等距离安放5个6个牛津杯，轻轻按压，量取多肽样品100L，缓缓 36℃土1℃C恒温培养箱中，正置培养至抑菌圈清晰，采用游标卡尺或抑菌圈测量仪测定抑菌圈直径，每 个抑菌圈沿不同方向测量3次，并记录平均值 以多肽稀释倍数倒数的对数值为横坐标，以抑菌圈直径为纵坐标，建立线性方程（R²≥0.9900）。 杆菌肽对S.aureusATCC25923的线性关系图参见附录B的图B.1。 7.2抗丝状真菌性能测定 7.2.1样品制备 同7.1,1。 7.2.2指示菌孢子悬液制备 7.2.2.1菌种活化 将指示菌孢子或菌悬液接种于PDA培养基的固体平板上，29℃士1℃恒温培养48h～72h，作为 72h，作为第二代孢子培养物；取第二代孢子培养物接种于PDA培养基的固体平板上，29℃土1℃恒温 培养48h～72h，作为第三代孢子培养物。 7.2.2.2孢子悬液制备 将第三代抱子培养物用0.85%生理盐水洗脱抱子，血球计数板计数，将孢子浓度调整至1× 105CFU/mL~5X10°CFU/mL。 7.2.3检测平板制备 将配制的PDA培养基加热溶解，冷却至45℃～50℃，将制备的指示菌孢子悬液按照1%的添加量 加入PDA培养基中，充分混合均匀，量取20mL倾倒入灭菌平皿，轻轻摇动平板使之均匀铺平，待其凝 固后备用。 7.2.4测定 在含有指示菌的检测平板中等距离安放5个6个牛津杯，轻轻按压，量取多肽样品100L，缓缓 29℃土1℃恒温培养箱中，正置培养18h～24h至抑菌圈清晰，此时指示菌为菌苔状，基本还未形成菌 3 GB/T39101—2020 以多肽稀释倍数倒数的对数值为横坐标，以抑菌圈直径为纵坐标，建立线性方程（R²0.9900）。 硫酸多粘菌素B对A.nigerATCC16404的线性关系图参见图B.2。 8 试验数据处理 抗菌性按式（1）计算： 1 V×10x×C 式中： U——抗菌效价，单位为AU每毫克（AU/mg）； V样品的测定体积，单位为毫升（mL)； X。线性方程的X轴截距； C一一样品的初始测定浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）。 计算结果以3次平行测定值的算术平均值表示，保留两位有效数字。 4 GB/T39101—2020 附录A （资料性附录） 培养基 A.1营养肉汤培养基（NutrientBroth，NB) A.1.1将蛋白陈10g、牛肉膏3g、氯化钠5g放人1000mL一级水中，煮沸溶解，调节pH值至7.2~ 7.4，分装后于高压蒸汽灭菌器中，121℃士1℃灭菌20min。 A.1.2可采用市售的商业培养基，使用时严格遵照制造商的使用说明。 A.2 营养琼脂培养基（NutrientAgar，NA） A.2.1 将蛋白陈10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g放入1000mL一级水中煮沸溶解，调节pH 值至7.2~7.4，分装后于高压蒸汽灭菌器中，121℃土1℃灭菌20min。 A.2.2 2可采用市售的商业培养基，使用时严格遵照制造商的使用说明。 A.3 马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（PotatoDextroseAgar，PDA） 20 min。 A.3.2 2可采用市售的商业培养基，使用时严格遵照制造商的使用说明。 SAC 5