ICS07.080 A 21 中华人民共和国国家标准 GB/T 38792—2020 蛋白质致敏性细胞学评价技术规范 Technical specification for cytological evaluation of protein allergenicity 2020-04-28发布 2020-11-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T38792—2020 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由中国标准化研究院提出并归口。 公司。 本标准主要起草人：马爱进、吴晓玲、胥传来、匡华、袁爱梦、刘丽强、马伟、徐丽广、王忠兴、郝帅、 柴艳兵、张耀广。 1 GB/T38792—2020 蛋自质致敏性细胞学评价技术规范 1范围 本标准规定了蛋白质致敏性细胞学评价要求、证实方法。 本标准适用于由免疫球蛋白E（IgE）介导的食品蛋白质致敏性的细胞学评价。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 蛋白质致敏性proteinallergenicity 由蛋白质诱发机体发生过敏反应的特性。 糖苷酶释放的程度。 4要求 4.1按照相关法律法规和标准要求对样品进行接收、保管、交接、配制、回收、退还/销毁处理，并制定相 应的管理制度和程序。 4.2实验室应符合生物安全一级要求。细胞实验工作区一般要由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保存室 组成。其中，缓冲间面积应不小于3m，并设有更衣柜和紫外灯，紫外灯的强度为不少于1.5W/m。 紫外灯源距地面不应超过2.5m，每次照射时间为20min～30min。无菌室无菌等级的最低标准应达 到万级。 4.3评价使用的仪器与设备种类、数量、性能、量程、精度应能满足评价的需要。评价需要的器血材料 应经过无菌处理，试验操作过程均为无菌操作。 4.4实验用水应满足GB/T6682的要求，所使试剂使用前都需经无菌处理。 4.5评价实验结束后，实验材料应进行无害化处理。 4.6蛋白质致敏性评价结果以β-氨基已糖苷酶最大释放率表示 4.7 评价结果应表述出评价蛋白的名称、纯度、使用浓度、β-氨基已糖苷酶最大释放率。 1 SAG GB/T38792—2020 5证实方法 5.1β-氨基己糖苷酶释放率测定 5.1.1样品前处理 5.1.1.1固体样品 5.1.1.1.1植物性样品 将待测样品粉碎、450um微孔滤膜过滤后，准确称取5.00g于聚内烯离心管中，向离心管中加人 40mL水，充分振荡混匀。将离心管水平置于振荡器中，室温下100次/min，振荡12h，5000r/min离 心10min，小心吸取上清液于另一个干净的聚丙烯离心管中，真空冷冻干燥，固体蛋白粉末可于2℃～ 8℃贮存，时间不超过24h。 5.1.1.1.2动物性样品 将待测样品搅碎匀浆后，准确称取5.00g，置于漏斗中，加入50mL石油醚进行连续3次冲洗后，放 入烘箱中烘干。将烘干后的样品置于聚内烯离心管中，向离心管中加入10mL15%三氯乙酸溶液（体 积分数），充分振荡混匀，静置10min。样品溶液5000r/min离心10min，小心吸取上清液于另一个干 5.1.1.2液体或半液体样品 称取5.00g液体样品，置于漏斗中，加入50mL石油醚进行连续3次冲洗后，放入烘箱中烘干。将 烘干后的样品置于聚内烯离心管中，加入40mL水，充分振荡混匀匀，将离心管水平置于振荡器中，室 温下100次/min，振荡过夜12h，5000r/min离心10min，小心吸取上清液于另一个干净的聚丙烯离 心管中，真空冷冻干燥，固体蛋白粉末可于2℃～8℃贮存，时间不超过24h。 5.1.2样品溶液制备 质量浓度为1mg/mL的储备溶液。试验时用Tyrodes液（参见附录A）稀释成一定浓度的工作液，现 用现配。 5.1.3细胞培养 SZC 37℃，5%二氧化碳细胞培养箱中培养48h～72h，倒置显微镜下观察细胞生长情况。当细胞生长至培 养瓶的80%~90%时，进行细胞计数和细胞接种。 5.1.4细胞接种 将细胞培养液从细胞培养瓶内吸出，用PBS缓冲液洗细胞一次。向细胞培养瓶内加人2.0mL胰 蛋白酶溶液（参见附录A），于37℃消化2min～4min。在倒置显微镜下观察细胞消化情况，当细胞变 液。吸取细胞悬液，以200μL/孔加到细胞培养板中，使细胞接种密度为1×105细胞/mL。37℃，5% 二氧化碳细胞培养箱中培养24h使其贴壁 2 GB/T38792—2020 5.1.5细胞活化 将细胞培养液从细胞培养板内吸出，用PBS缓冲液洗细胞三次。以200uL/孔向细胞培养板内加 入含50μg/mLIgE（参见附录A)的细胞培养液，37℃,5%二氧化碳细胞培养箱中继续培养24h 5.1.6细胞与蛋白的激发作用 5.1.6.1样品组 将细胞培养液从细胞培养板内吸出，用PBS缓冲液洗细胞三次。分别以50μL/孔向细胞培养板内 加入不同浓度的待测蛋白工作液，37℃，5%二氧化碳细胞培养箱中反应45min。反应结束后，放人冰 水中终止反应。上述各项均设3个复孔。 5.1.6.2全部释放组 将细胞培养液从细胞培养板内吸出，用PBS缓冲液洗细胞三次。以50μL/孔向细胞培养板内加入 部细胞培养上清，1200r/min离心5min，收集细胞上清液。上述设3个复孔。 5.1.6.3空白对照组 将细胞培养液从细胞培养板内吸出，用PBS缓冲液洗细胞三次。以50μL/孔向细胞培养板内加入 Tyrode's液，37℃，5%二氧化碳细胞培养箱中反应45min。反应结束后，放入冰水中终止反应。上述 设3个复孔。 5.1.7测定 吸取5.1.6中作用后的反应液，以30uL/孔转移至新的细胞培养板中，以50uL/孔向细胞培养板内 加入PNP-NAG溶液（参见附录A），37℃反应1h后，以200μL/孔加碳酸钠终止液（参见附录A）终 止反应，用酶标仪在波长405nm处测各孔吸光度值。样品组的吸光度标记为Ai，空白对照组的吸光 度标记为A。，全部释放组标记为Am。 5.2β-氨基已糖苷酶释放率结果计算 3-氨基已糖苷酶释放率按式（1）计算： (A-A) 式中： R—β-氨基己糖苷酶释放率； A———样品组的吸光度； A。——空白对照组的吸光度； A㎡—全部释放组的吸光度。 平行样的平均值为最终释放率值，计算结果保留到小数点后两位。 3 GB/T38792—2020 附录A （资料性附录） 溶液配制 A.1水 GB/T6682规定的二级水。 A.20.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液） 称取7.90g氯化钠、1.44g磷酸氢二钠、1.80g磷酸二氢钾、0.20g氯化钾，用980mL水溶解，用盐 酸调节pH至7.2，再加水定容至1000mL，0.22um微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用或选用同类商品 化产品。 称取34.2mgPNP-NAG，加水溶解并定容至100mL，0.22um微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用。 A.40.1mol/L碳酸钠终止液 称取1.06g碳酸钠，加水溶解并定容至100mL，0.22μm微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用。 A.5台氏液（Tyrode's液） 称取7.90g氯化钠、0.20g氯化钾、0.26g七水硫酸镁、0.07g二水磷酸二氢钠、1.00g碳酸氢钠、 0.20g氯化钙和1.00g葡萄糖，用980mL水溶解，用盐酸调节pH至7.2，再加水定容至1000mL， 0.22um微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用或选用同类商品化产品。 A.6细胞培养液 Eagle最低必需培养基（Eagle'sMinimalEssentialMedium，MEM），加人小牛血清和青霉素-链霉 素，配制成含体积分数为10%小牛血清、1%青霉素-链霉素的细胞培养液，其中青霉素和链霉素的终浓 度分别是100U/mL和100μg/mL。EMEM培养基可选用各种商品供应的粉末培养基，按生产厂商提 供资料配制并除菌，4℃保存备用。 A.7细胞裂解液 商品化1%TritionX-100细胞裂解液，主要成分为50mmolTris-HCl(pH7.2）、150mmol氯化钠 和5mmol乙二胺四乙酸、体积分数为1%曲拉通X-100。0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用 GB/T38792—2020 A.8 胰蛋白酶溶液 称取2.50g胰蛋白酶（活力1：250），加入1000mLPBS缓冲液（A.2），混匀，0.22μm微孔滤膜过 滤除菌，4℃保存备用或选用同类商品化产品。 A.9 嗜碱性粒细胞（RBL-2H3细胞） 大鼠嗜碱性粒细胞性白血病细胞，ATCCCRL-2256细胞株。 A.10 IgE球蛋白 鼠源，纯度>95%，质量浓度>50ug/mL，可选用各种同类商品化产品。 5