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ICS 07.080 C30 中华人民共和国国家标准 GB/T 37908—2019 基于光学椭偏成像的无标记蛋白质芯片 分析方法通则 General analysis regulation of the label-free protein microarray based on imaging ellipsometry 2020-05-01实施 2019-10-18发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T37908—2019 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草, 本标准由全国生物芯片标准化技术委员会(SAC/TC421)提出并归口。 本标准起草单位:中国科学院力学研究所、贵州金玖生物技术有限公司。 本标准主要起草人:靳刚、牛宇、韩克兵、王磊。 GB/T37908—2019 基于光学椭偏成像的无标记蛋白质芯片 分析方法通则 1范围 本标准规定了基于光学椭偏成像的无标记蛋白质芯片的术语和定义、原理、仪器组成与要求、技术 指标、测试方法和检测分析方法与步骤。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T27990—2011生物芯片基本术语 GB/T28641—2012蛋白质微阵列芯片通用技术条件 JJF1265生物计量术语及定义 3术语和定义 3.1 无标记蛋白质芯片label-freeproteinmicroarray 能够直接将探针分子识别靶标分子的过程定性或定量显示,而无需借助物理、化学或生物的方法 (如放射性元素标记、荧光标记等)对识别过程进行标记的蛋白质芯片。 3.2 质量面密度 surfacemassdensity 单位面积的蛋白质芯片表面上生物分子的质量。 3.3 芯片布局 microarray design 由检测需求和待测靶标分子性质所决定的,探针分子在芯片表面上的设计和排布 3.4 表面改性 E surface modification 采用物理、化学、生物学方法,为实现探针分子的组装和阻隔非特异性吸附的目的,对芯片基底进行 表面处理的过程。 3.5 探针组装probeimmobilization 通过物理吸附、共价结合和定向固定等方法,将探针分子装配到芯片表面上的过程。 3.6 分子识别 Jrecognition 利用生物分子间的特异亲和性,实现探针分子对靶标分子特异性捕获的过程。 1 GB/T37908—2019 3.7 标准片calibration substrate 预先在抛光硅基片上制作并进行厚度标定的二氧化硅膜层。膜层厚度在1nm~20nm范围内,成 台阶状分布。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 anti-IgG:抗免疫球蛋白抗体(Anti-ImmunoglobulinGAntibody) BSA:牛血清白蛋白(AlbuminfromBovineSerum) CCD:电荷耦合元件(Charge-coupledDevice) IgG:免疫球蛋白(ImmunoglobulinG) ROC:受试者工作特征(Receiver Operating Characteristic) 5原理 基于光学椭偏成像的无标记蛋白质芯片是将多元蛋白质芯片技术和高空间分辨率的光学椭偏成像 技术相结合发展而成的一种无标记、快速、高灵敏度、多通量、自动检测的蛋白质分子间相互作用分析方 法,具有如下特点: a) 样品无需标记、直接检测; b) 集成了芯片制备和检测功能,可快速进行多指标、多样本的并行检测; c) 主动输运式分子反应,速度快、样品消耗少; 采用高空间分辨光学椭偏成像测量,非接触、无扰动、对样品无破坏、检测灵敏度高,可进行定 性和定量检测; e)结果直观,可鉴别伪信号。 在用于蛋白质分子间相互作用检测时,首先将探针分子分别装配在芯片基底的格式化表面上各个 单元中,形成格式化的探针微阵列。当含有靶标分子的溶液输运到探针微阵列后,探针分子由于分子识 别会与靶标分子发生特异性结合,导致该反应单元上质量面密度增加。具有原子层量级厚度分辨能力 的光学椭偏成像技术对这一变化及其敏感,可以定量显示质量面密度的变化,实现靶标分子的检测,判 断靶标分子的存在与否或含量多少。 6仪器组成及要求 6.1芯片反应器 芯片反应器用于实现蛋白质芯片的表面格式化、溶液输运、样品分配、探针组装以及探针分子对靶 标分子的识别、清洗和吹干等过程,由此生成适用于椭偏成像技术检测的多元蛋白质芯片。芯片反应器 由微量流体泵、微量液池、微流道输运系统、微反应器阵列、清洗吹干装置和机械运动组件以及控制装置 等组成。其基本工作原理是:适时、定量、按程序在微量流体泵的推动下将各种溶液输送到微反应器的 指定的反应单元中,进行探针装配及生物分子与探针相互作用。其中,微量流体泵多采用多通道蠕动 泵,流量在1μL/min~50uL/min范围内可控,并至少具有八个独立通道。微量液池的容积不少于 0.2mL。微流道输运系统采用聚四氟乙烯材质制作。微反应器阵列至少为独立八单元,每反应单元的 容积不多于500μL,相邻两反应单元的距离大于2mm。清洗吹干装置能够实现1μL/min~50uL/min流 速范围内液路清洗和10kPa~50kPa压力范围内的气路吹干。 2 GB/T37908—2019 6.2芯片检测器 反应单元上靶标分子与探针分子相互作用的结果,计算出靶标分子溶液浓度等。芯片检测器通常包括 入射光源、扩束准直光路、起偏器、补偿器、样品台、检偏器、成像系统、CCD、图像采集部分和控制部分 等。其基本工作原理是:扩展的偏振光束平行地照射到芯片表面上,芯片对探测光束进行调制从而使得 反射光波中载有芯片的信息,再经检偏部分,由CCD摄取图像。最后利用图像灰度与靶标分子的质量 面密度之间的关系,获得靶标分子溶液浓度。其中,入射光源的波长多用633nm,带宽50nm,功率稳 定性优于2%。扩束准直光路直径大于1cm,照度均匀性高于95%。起偏器、补偿器和检偏器的消光 比大于1000:1(针对中心波长)。样品台被检测面与自准直仪光轴垂直度在30"范围内,工作台倾斜 调整精度小于1',工作台升降调整精度小于0.01mm。CCD的信噪比高于60dB,照度高于0.2lm。 6.3计算机操控系统 计算机操控系统是以计算机作为信息处理中心,对系统各部分,包括,微流道芯片反应器和芯片检 测器,进行操作和自动控制,并实现对系统数据和检测结果的采集、处理和分析。计算机操控系统包括 计算机、运动控制器、操作和控制软件以及图像采集、处理和分析软件。其基本工作原理是:根据芯片制 备和靶标分子检测的要求,在操作和控制软件的指令下,计算机通过控制器对芯片反应器和芯片检测器 中的机械运动和数据采集进行程序控制,其控制定位精度小于0.02mm,运行速度小于300mm/s,实 现适时、定量、按程序的运行效果,数据结果反馈回计算机和控制器进行处理;在图像处理和分析软件的 指令下,计算机进行图像采集、处理和数据分析,获得检测结果的数据,并打印输出。 7仪器的性能指标及测试方法 7.1正常工作条件 在如下条件下进行试验: a)电源:交流220V±22V;50Hz±1Hz; b)环境温度:10℃~30℃; c) 相对湿度:30%~75%; d)大气压力:86kPa~106kPa。 7.2检测动态范围 检测动态范围是指仪器能够检测的靶标分子浓度的有效范围。检测前,需要利用硅基底上带有 2nm、4nm和8nm厚度台阶的二氧化硅膜层标准片检查仪器的动态检测范围是否达到要求,具体测 试步骤为: a) 将标准片置于芯片检测器平台上,分别对基底2nm、4nm和8nm台阶部分进行测量,读取各 梯度样品的信号值(Y),进行分析; b) 调整芯片检测器中起偏器和检偏器的角度,使上述四个测量值(Y)与厚度(X,)之间均于线 性,利用式(1)计算的相关系数应大于95%。 Z(X -X) : (Y, -Y) 相关系数= ..(1) VE(X,-X)2: VE(Y,-Y) 7.3最低检测限 最低检测限是指仪器能够检测出的某类待测靶标分子溶液的最低浓度值,具体测试步骤为: 3

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