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ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 35910—2018 猪圆环病毒 2型阻断ELISA 抗体检测方法 Blocking enzyme-linked immunosorbent assay for detecting the antibody to porcine circovirus type 2 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35910—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:南京农业大学。 本标准起草人:姜平、王先炜、白娟、杨香林、刘捷。 1 GB/T 35910—2018 猪圆环病毒2型阻断ELISA 抗体检测方法 1范围 本标准规定了猪圆环病毒2型抗体阻断ELISA的检测方法。 本标准适用于猪圆环病毒病的抗体检测、疫苗免疫抗体监测和血清流行病学调查, 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 SN/T 2984 检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BSA:牛血清白蛋白(Bovine serumalbumin) ELISA:酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbentassay) HRP:辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase) PCV2:猪圆环病毒2型(Porcinecircovirustype2) TMB:四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine) 4 仪器、材料与试剂 4.1 试验仪器 4.1.1 酶联免疫检测仪。 4.1.2 高速台式冷冻离心机。 4.1.3 微量移液器:规格0.5μL~10μL、20μL~200μL、100μL~1000μL。 4.1.4 12道可调微量移液器:规格10μL~100μL。 4.2 试验材料 4.2.196孔酶标反应板。 4.2.2 注射器(5mL)。 4.2.3 微量离心管(1.5mL)。 4.2.4 吸头(可与移液器配套)。 1 GB/T35910—2018 4.3主要试剂 4.3.1 PCV2重组核衣壳蛋白(Cap)抗原(见附录A)。 4.3.2辣根过氧化物酶(HRP)标记的PCV2单克隆抗体。 4.3.3PCV2阳性对照血清和阴性对照血清(见附录A)。 4.3.4四甲基联苯胺(TMB)(见附录B)。 4.3.5商品化PCV2ELISA抗体检测试剂盒。 5PCV2抗体阻断ELISA检测方法 5.1 样品采集、运输与保存处理 5.1.1基本要求 按NY/T541采集猪血液,按SN/T2984处理待检猪。另外,按GB19489进行检测。 5.1.2样品采集与运送 采用消毒注射器经猪颈静脉采集血液2mL,凝固后24h内在冷藏条件下送到实验室。若不能及 时送往实验室,则应分离血清,放人无菌微量离心管中置一20℃保存,并在冻结状态下送往实验室。 5.1.3血清分离与保存 取凝固血液,2000r/min离心5min,收集上清,放人无菌微量离心管中,立即用于抗体检测,或置 一20℃保存。要求血清清亮,无溶血。 5.2ELISA操作步骤 5.2.1抗原包被板的制备: a)抗原包被:用抗原包被液(见B.1)将PCV2Cap蛋白(见A.1)稀释成2.0μg/mL,加入96孔酶 标反应板,每孔100μL,置37℃2h; 一次拍干; d)加保护剂:弃去孔中液体,按5.2.1b)洗涤3次,加入抗原保护剂(见B.3),100μL/孔,置37℃ 下作用1 h; 密封:置37℃晾干,用锡箔纸真空包装,密封。 e) 5.2.2血清样品稀释和加样: 取出抗原包被板并在记录表(表1)上标记待检样品(YPi~YP,)的位置。用血清稀释液(见B.4)在 稀释板内将待检血清1:1稀释,即每孔先加50μL样品稀释液,再加50uL待检血清,混勾后,按记录 表中标记的对应于抗原包被板上的位序,依次加入到YP1、YP2、YP、…等位置的各孔中。吸取每份 血清时均应更换吸头。 待检血清样品数量较多时(≥10份),应先使用血清稀释板稀释所有待检血清,再将稀释好的血清 转移到抗原包被板,以尽可能使反应时间一致。 2 GB/T 35910—2018 表 1 样品加样记录表(推荐模式) 2 3 4 5 6 7 10 1 8 11 12 9 YPIs YP21 YP29 A - B YPl4 YP22 + + YP3o YP1s c YPi YP, YP23 YPa1 D YP2 YPs YP16 YP24 YP32 E YP3 YPs YP17 YP25 YPa3 F YP. YPlo YPIs YP26 YPaa G YPs YPu YP19 YP27 YPas H YP. YP12 YP20 YP28 YP36 注:一为阴性对照;十为阳性对照;YPi为样品1,其余类推。 5.2.3加对照血清:用血清稀释液(见B.4)将阳性对照血清(见A.2.1)、阴性对照血清(见A.2.2)分别做 1:1稀释后,各取100uL阴性对照血清分别加入A1孔和A2孔,各取100uL阳性对照血清分别加入 B1孔和B2孔。吸取不同血清时需要更换吸头。 5.2.4混合孵育:轻轻振荡微量反应板(孔中样品勿溢出),用封条封闭,置37℃下孵育2h。 5.2.5洗涤:同5.2.1b)。 5.2.6加酶标单抗和孵育:每孔加入100μL工作浓度的HRP标记的PCV2单克隆抗体,37℃孵育 30min。该试剂使用前恢复到室温,使用后放回2℃~8℃。 5.2.7洗涤:同 5.2.1 b)。 照显蓝色、阳性对照基本不显色时,每孔加人50μL终止液(见B.7)。 5.2.9 在酶联免疫检测仪450nm波长处读取各孔的OD值数,15min内完成。 5.3结果判定 5.3.1 结果计算 阴性对照平均OD值(NCx)见式(1): NCx=(A1孔OD值+A2孔OD值)/2 (1) 阳性对照平均OD值(PCx)见式(2): PCx=(B1孔OD值+B2孔OD值)/2 (2 ) 样品阻断率的计算见式(3): 阻断率(PI)=(NCx一样品OD值)/NCx×100% (3) 5.3.2判定 NCx大于0.7,PCx小于0.4时,试验条件成立。当PI≥38%判为阳性,PI≤30%判为阴性,30%< PI<38%判为可疑,对可疑样品重新检测一次,PI<38%,判为阴性。 或使用商品化PCV2ELISA抗体检测试剂盒,其操作和判定按其说明书进行。 3

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