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ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 35901—2018 猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法 Real-time PCR method for detection of porcine circovirus type 2 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35901—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 人民共和国深圳出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、湖南圣湘生物科技有限公司。 本标准主要起草人:张强、李健、熊炜、童光志、赵和平、花群义、李树清、杨忠苹、李国新、王巧全、 王艳、林颖、蔡开妹、喻正军、吴绍强、林祥梅。 GB/T 35901—2018 猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了猪圆环病毒2型荧光PCR检测的操作方法。 本标准适用于猪圆环病毒2型核酸检测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 2分析实验室用水规格和试验方法 GB/T25172猪常温精液生产与保存技术规范 3 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 荧光PCR:荧光聚合酶链式反应(real-timepolymerasechainreaction) Ct值:每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数(cyclethreshold) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) Taq 酶:Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase) TE缓冲液:Tris-EDTA缓冲液(Tris-EDTAbuffer) PCV:猪圆环病毒(porcine circovirus) 4. 仪器设备 4.1 荧光PCR检测仪。 4.2 高速台式冷冻离心机:可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上。 4.3 普通冰箱:2℃~8℃。 4.4 普通冰柜:一20℃以下。 4.5 超低温冰箱:可控温至一70℃以下。 4.6 微量移液器:0.2μL~2μL、1μL~10μL、10μL~100μL、20μL~200μL、100μL~1000μL,并 配备与移液器匹配的吸头。 4.7 高压灭菌锅。 5 耗材 5.11.5mL离心管。 5.20.2mLPCR薄壁管或八联管。 SAG 1 GB/T35901—2018 6试剂 6.1 除非另有说明,在检测中使用的试剂均为分析纯,实验室用水应符合GB/T6682的要求。 6.2DNAzol,商品化DNA抽提试剂,于2℃~8℃保存。 6.3无水乙醇,一20℃预冷 6.475%乙醇,无水乙醇和双蒸水配制,一20℃预冷。 6.58mmol/LNaOH溶液,配制见附录A。 6.6PBS缓冲液(0.01mol/LPBS,pH7.4),配制见附录A。 6.7Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液:Taq酶浓度为5U/uL,Taq酶反应缓冲液中Mg2+浓度 为15mmol/L。 6.8dNTPs:含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol/L,一20℃保存,避免反复冻融 6.9 引物和TaqMan探针,其序列见附录B。 6.10猪圆环病毒2型阳性对照样品和阴性对照样品:阳性对照使用灭活疫苗或组织培养灭活毒, 一20℃保存备用;阴性对照可采用健康猪的组织材料。 6.11内参照质粒:带有人β-珠蛋白基因的质粒。 7样品采集和处理 7.1买 采样工具 7.1.1手术刀、剪刀、镊子,经160℃干热灭菌2h。 7.1.2组织研磨器或者研钵,经160℃干热灭菌2h。 7.1.3真空采血管。 7.2 样品菜集 7.2.1血清样品采集:用无菌注射器抽取受检猪静脉血不少于5mL,置于无菌离心管内,室温或者 37℃倾斜放置自然凝集20min~30min,2000r/min~3000r/min离心10min,吸取上清液到新的 离心管内备用 7.2.2粪便样品采集:取猪新鲜粪便1g,装人15mL灭菌离心管中,加人5mLPBS,混匀。 7.2.3精液样品采集:按照GB/T25172的方法采集和保存精液。 7.2.4组织样品采集:采取病死猪(包括流产的死胎)或扑杀猪主要脏器(淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏和肝 脏)装人灭菌15mL离心管中,编号,送实验室, 7.2.5细胞培养物:细胞培养物反复冻融3次,第3次解冻后,将细胞培养物置于1.5mL无DNA酶的 灭菌离心管内,编号备用。 7.3 3样品保存和运输 一20℃士5℃可以稳定保存3个月,一70℃以下可长期保存。样品运送采用低温保存进行运输,并在 规定温度下的保存期内送达。 7.4样品处理 7.4.1血清和精液样品无需进行前处理,直接用于核酸提取。 7.4.2粪便样品:3000r/min离心10min,取上清液,转入1.5mL离心管中,用于后续的核酸提取 2 GB/T35901—2018 5min,取上清用于后续的核酸提取。 7.4.4细胞培养物:4.000r/min,4℃离心10min,取上清用于后续的核酸提取。 8荧光PCR操作程序 8.1DNA抽提 8.1.1在核酸提取区操作。DNA抽提使用DNAzol试剂提取,也可以使用等效商品化试剂盒提取 8.1.2取n个灭菌的1.5mL离心管,其中n为待检样品数十阳性对照十阴性对照,对每个离心管进行 编号。 匀,4℃或室温10000r/min离心10min。 8.1.4取900μL上清,置新的1.5mL灭菌离心管中,加人500μL无水乙醇,混勾,室温放置3min; 4℃或室温10000r/min离心5min。 8.1.5弃上清,沿管壁缓缓加入0.8mL~1mL75%乙醇,颠倒3次~6次混勺,4℃10000r/min离 心5min。反复洗涤两次后,将离心管倒扣于吸水纸上,自然晾干或用移液器移去残液。 8.1.6用50uL8mmol/LNaOH溶液溶解沉淀,DNA在2℃~8℃冰箱可保存两个月,一20℃冰柜 可稳定保存两年。 8.2荧光PCR检测 8.2.1反应体系的配制 在试剂配制区进行。设实时荧光PCR反应管数为n,n为待检样品数十阳性管数十阴性管数,每 个反应的体系见附录C,为了避免移液器取样损失,建议按n十1个反应进行配制。配制反应液在冰盒 中进行。 8.2.2反应液的分装 将8.2.1中配制的荧光PCR反应液充分混匀,按照每管39.8μL分装于0.2mL透明PCR管内,将 PCR管置于96孔板上,按顺序加样并做好标识,转移至核酸提取区。 8.2.3加样 在核酸提取区进行。在每个PCR反应管内加人0.2μL的内参照质粒,并分别加入8.1制备的核酸 10μLDNA溶液,盖上盖子,500r/min~1000r/min离心30s。转移至检测区 8.2.4上机检测 8.2.4.1荧光通道设置 在检测区进行。将8.2.3中离心后的PCR管放人荧光PCR检测仪内,设置探针:5选择FAM和 HEX两个荧光通道,3均选择无(None)。 8.2.4.2循环条件设置与检测 第一阶段,预反应50℃/2min; 第二阶段,预变性95℃/2min; 第三阶段,变性95℃/15s,退火、延伸、荧光采集60℃/30s,40个循环; 3

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