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ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T 17813—2018 代替GB/T17813—1999 添加剂预混合饲料中烟酸与叶酸的测定 高效液相色谱法 Determination of nicotinic acid and folic acid in premix- High performance liquid chromatography 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 17813—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准代替GB/T17813—1999《复合预混料中烟酸、叶酸的测定高效液相色谱法》。 本标准与GB/T17813一1999相比,除编辑性修改外,主要技术内容修改如下: 修改了方法的检测限,增加了定量限(见第1章,1999年版的第1章); 修改了标准名称; 修改了烟酸、叶酸测定原理(见第3章和第4章,1999年版的第3章); 修改了烟酸和叶酸的提取液组成(见第3章和第4章,1999年版的4.6); 修改了烟酸和叶酸流动相与色谱条件(见3.2.7、3.5.2和4.5.2,1999年版的7.2.1.1); 修改了烟酸标准溶液的配制方法(见3.2.9,1999年版的4.5.1); 复合预混合饲料提取方法中,增加了二水合乙二胺四乙酸二钠(EDTA)使用(见3.5.1.2和 4.5.1.2,1999年版的7.1); 增加了烟酸、叶酸的标准色谱图(见附录A)。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。 本标准起草单位:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心 (北京)。 本标准主要起草人:李兰、贾铮、索德成。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为: GB/T17813—1999。 1 GB/T17813—2018 添加剂预混合饲料中烟酸与叶酸的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准适用于维生素预混合饲料及复合预混合饲料中烟酸、叶酸的测定 烟酸的检测限为100mg/kg,定量限为300mg/kg;叶酸的检测限为15mg/kg,定量限为50mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 3烟酸的测定 3.1原理 试样中烟酸用酸性甲醇水溶液提取,采用高效液相色谱仪分离,紫外检测,外标法定量。 3.2 2试剂或溶液 除特殊注明外,本标准所用试剂均为分析纯,水符合GB/T6682中一级水的规定。 3.2.1冰乙酸:优级纯 3.2.2庚烷磺酸钠:色谱纯。 3.2.3三乙胺:优级纯 3.2.4甲醇:色谱纯。 3.2.50.1%三氟乙酸溶液:移取1mL三氟乙酸于1000ml水中。 3.2.6提取液:称取50mg二水合乙二胺四乙酸二钠(以下简称EDTA)溶于约800mL水中,加入 20mL冰乙酸(3.2.1)、5mL三乙胺(3.2.3),混匀后与200mL甲醇混合,该溶液pH值约为3~4。 3.2.7流动相:称取1.1g庚烷磺酸钠(3.2.2)、50mgEDTA溶于约1000mL水中,加人20mL冰乙酸 (3.2.1)、5mL三乙胺(3.2.3),混匀,用冰乙酸、三乙胺调节溶液pH值为4.0,过0.45μm滤膜。取上述 溶液800mL与200mL甲醇(3.2.4)混合,备用。 3.2.8烟酸标准品:烟酸含量≥98.0%。 3.2.9烟酸标准储备溶液:准确称取0.1g(精确到0.0001g)烟酸标准品(3.2.8),置于100mL棕色容 量瓶中,加水使其溶解,并加人1mL0.1%三氟乙酸溶液(3.2.5),用水定容至刻度,摇匀。该标准储备 液中烟酸含量约为1mg/mL,2℃~8℃保存,有效期为6个月。 3.2.10烟酸标准工作液:根据试样种类(维生素预混合饲料、复合预混合饲料)调整稀释倍数,使标准 1 GB/T17813—2018 工作液浓度在10μg/mL150μg/mL,用提取液(3.2.6)稀释定容。当日制备并使用。 3.3仪器设备 3.3.1 天平:感量0.0001g、感量0.001g。 3.3.2离心机:转速不低于8000r/min(相对离心力不低于6010g)。 3.3.3超声波水浴。 3.3.4高效液相色谱仪:配紫外可调波长检测器(或二极管矩阵检测器)。 3.4样品 按照GB/T14699.1抽取有代表性的饲料样品,用四分法缩减取样。按GB/T20195制备试样,粉 碎过0.425mm孔径筛,充分混匀,储存在密闭容器中,避光保存。 3.5试验步骤 3.5.1试样的提取 3.5.1.1维生素预混合饲料的提取 称取试样0.5g(精确到0.001g),置于100mL棕色容量瓶中,加入提取液(3.2.6)约70mL,边加边 摇勾后置于超声水浴中超声提取15min,期间摇动2次,待冷却后用提取液(3.2.6)定容至刻度,摇匀。 取约25mL上述溶液于离心机8000r/min离心5min,取上清液用提取液(3.2.6)稀释10倍后过 0.45μm微孔滤膜,上机测定。 3.5.1.2复合预混合饲料的提取 称取试样约1g(精确到0.001g),置于100mL棕色容量瓶中,加入1gEDTA钠盐,边摇动边加人 提取液(3.2.6)约70mL,置于超声水浴中超声提取15min,期间摇动2次,待冷却后用提取液(3.2.6)定 容至刻度,摇匀。取适量溶液于离心机8000r/min离心5min或过滤,取上清液过0.45um微孔滤膜, 上机测定。 3.5.2参考色谱条件 色谱柱:Cis柱,长250mm,内径4.6mm,粒径5uμm或性能相当者。 流动相:见3.2.7。 流速:1.0mL/min。 温度:室温。 检测波长:262nm。 进样量:20μL。 3.5.3测定 取烟酸标准工作液(3.2.10)和试样溶液(3.5.1)分别进样,得到色谱峰面积响应值,在线性范围内, 用外标法单点校正,测定,以保留时间定性,峰面积定量。烟酸标准色谱图参见附录A中图A,1。 3.6试验数据处理 试样中烟酸的含量,以质量分数计,数值以毫克每千克(mg/kg)表示,按式(1)计算: PXVXcXVs w= ..(1) Pst XmXV 2 GB/T17813—2018 式中: P一一试样溶液峰面积值; V 试样稀释体积,单位为毫升(mL): 烟酸标准溶液浓度,单位为微克每毫升(μg/mL); c Vi——试样溶液进样体积,单位为微升(μL); Vt一一烟酸标准溶液进样体积,单位为微升(uL); Pst—烟酸标准溶液峰面积平均值; m 试样质量,单位为克(g); 测定结果用平行测定的算术平均值表示,保留三位有效数字。 3.7精密度 对于烟酸含量小于或等于500mg/kg的添加剂预混合饲料,在重复性条件下获得的两次独立测定 结果与其算术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的10%。 其算术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的5%。 4叶酸的测定 4.1原理 试样中叶酸用弱碱液提取,采用高效液相色谱仪分离检测,紫外检测,外标法定量, 4.2试剂或溶液 除特殊注明外,本标准所用试剂均为分析纯,水符合GB/T6682中一级水的规定。 4.2.10.1mol/L碳酸钠溶液:称取5.3g无水碳酸钠,溶解于500mL水中。 4.2.22mol/L碳酸钠溶液:称取106g无水碳酸钠,溶解于500mL水中。 4.2.3饱和EDTA溶液:称取120gEDTA于1000mL烧杯中,加水1000mL,搅拌并超声溶解1h, 即得。 4.2.4复合预混料提取液:饱和EDTA溶液+2mol/L碳酸钠溶液溶液=80十25,pH=9。 4.2.5叶酸标准品:叶酸含量≥95.0%。 4.2.6叶酸标准储备溶液:准确称取0.05g(精确到0.0001g)叶酸标准品(4.2.5),置于100mL棕色容 量瓶中,加人0.1mol/L碳酸钠溶液(4.2.1),超声使其溶解,稀释定容至刻度,摇匀。该标准储备液中叶 酸含量为500μg/mL,2℃~8℃保存,有效期6个月。 4.2.7叶酸标准工作液:根据样品种类(维生素预混合饲料、复合预混合饲料)调整稀释倍数,使标准工 作液中叶酸浓度约为5.0μg/mL~10.0μg/mL,用0.1mol/L碳酸钠溶液(4.2.1)稀释定容。当日制备 并使用。 4.3仪器设备 同3.3。 4.4样品 同3.4。 3

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