ICS 67.050 CCS X 04 中华人民共和国国家标准 GB/T 42114—2022 木薯叶片中黄酮醇的测定 高效液相色谱法 Determination of flavonol in cassava leaves- High-performance liquid chromatography 2023-07-01实施 2022-12-30发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T42114—2022 前 言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国标准化研究院提出并归口。 研究院、浙江大学、中国热带农业科学院香料饮料研究所。 本文件主要起草人：王琴飞、张振文、陆柏益、杨丽、孙彩霞、张彦军、林立铭、余厚美、陆小静、韦卓文、 李开绵。 1 GB/T42114—2022 木薯叶片中黄酮醇的测定 高效液相色谱法 1范围 本文件描述了木薯（ManihotesculentaCrantz，Cassava)叶中4种黄酮醇化合物的高效液相色谱测 定方法。 本文件适用于木薯鲜叶和木薯干叶中杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷4种黄酮醇含量的测定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用干 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4原理 极管阵列检测器检测，根据保留时间定性和外标法定量 5 试剂和材料 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂，以及符合GB/T6682规定的一级水。 5.1试剂 5.1.1甲醇(CH:OH,CAS号：67-56-1)：色谱纯。 5.1.2无水乙醇（CH.CH2OH,CAS号：64-17-5）：色谱纯。 5.1.3磷酸(H,PO4,CAS号：7664-38-2)。 5.2试剂配制 5.2.150%乙醇水溶液（体积分数）：取500mL无水乙醇（5.1.2），加人500mL水，混勺。 5.2.20.2%磷酸水溶液（体积分数）：取2.0mL磷酸（5.1.3），置于1000mL容量瓶中，用水定容至刻 度，现配现用。 5.3标准品 5.3.1杨梅苷（myricetin-3-O-rutinoside，C27HsoO17，CAS号：41093-68-9）：纯度≥98.0%。 1 GB/T42114—2022 5.3.2芦丁（quercetin3-O-rutinoside，C2H3oO16，CAS号：153-18-4）：纯度≥98.0%。 5.3.3烟花苷（kaempferol-3-O-rutinoside，C27H3oO15，CAS号：17650-84-9）：纯度≥98.0%。 5.3.4水仙苷（isorhamnetin-3-O-rutinoside，C2sHa2O16，CAS号：604-80-8）：纯度≥98.0%。 5.4 标准溶液配制 5.4.1标准储备溶液 称取杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷标准品分别为100.0mg、600.0mg、300.0mg和100.0mg，加甲 醇（5.1.1)溶解并定容至100mL，配成质量浓度分别为1.0mg/mL、6.0mg/mL、3.0mg/mL和1.0mg/mL 标准储备液，于一18℃密封避光保存。保存期6个月。 5.4.2标准中间工作溶液 分别移取1.0mL的杨梅苷、芦丁、烟花苷、水仙苷标准储备溶液（5.4.1）于10mL棕色容量瓶中，用 50%乙醇水溶液（5.2.1）定容，获得4种黄酮醇标准品质量浓度分别为100.0μg/mL、600.0μg/mL、 300.0μg/mL、100.0μg/mL标准中间工作溶液，现配现用。 5.4.3系列混合标准工作液 准确移取一定体积的标准中间工作溶液（5.4.2），用50%乙醇水溶液（5.2.1）逐级稀释，配制成杨梅 苷质量浓度分别为0.25μg/mL、0.5μg/mL、2.5μg/mL、5.0μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL、 100.0μg/mL，芦丁质量浓度分别为0.15μg/mL、3.0μg/mL、15.0μg/mL、30.0μg/mL、150.0μg/mL、 300.0μg/mL、600.0μg/mL，烟花苷质量浓度分别为0.15μg/mL、1.5μg/mL、7.5μg/mL、15.0μg/mL、 75.0μg/mL、150.0μg/mL，300.0μg/mL，水仙苷质量浓度分别为0.15μg/mL、0.5μg/mL、2.5μg/mL、 5.0μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL的系列混合标准工作液，现配现用。 6仪器与设备 6.1高效液相色谱仪：配备紫外检测器或二极管阵列检测器。 6.2天平：感量0.1mg和0.01g。 6.3 超声波清洗器：功率≥500W。 6.4离心机：转速≥4200r/min，配15mL转子或适配器。 6.5电热恒温干燥箱。 6.6植物组织研磨仪。 6.7方 旋涡混合器。 6.8 离心管：15mL和50mL。 6.9 容量瓶：10mL和1000mL。 6.10 移液管：0.lmL、0.2mL、0.5mL和1.0mL。 PTFE亲水微孔滤膜或相当性能的滤膜：孔径0.22μm。 6.11 7试样制备与保存 7.1木薯鲜叶 取适量木薯新鲜叶片（不带叶柄），擦拭干净表面尘土或水分，用液氮速冻后研磨至粉末，装人洁净 的离心管中。试样制备后于一18℃以下密封避光保存。保存期1年。 2 GB/T 42114—2022 7.2木薯干叶 取适量的木薯干叶（不带叶柄），用植物组织研磨仪研磨至粉末，过0.2mm的筛，混匀，装入洁净的 密封袋中。试样制备后于8℃以下密封避光保存。保存期1年。 8测定步骤 8.1提取 （5.2.1）5.0mL，旋涡振荡混匀，超声提取60min（50℃，500W），离心10min（4200r/min，25℃），上清 液转移至10mL容量瓶中，残渣再加入50%乙醇水溶液（5.2.1)5.0mL，旋涡振荡混匀，离心5min （10000r/min，25℃），合并两次离心的上清液，加人50%乙醇水溶液（5.2.1）定容至10mL，旋涡振荡 检测。 8.2测定 8.2.1色谱参考条件 高效液相色谱仪（6.1）的色谱参考条件如下： a） Ci8柱（250mm×4.6mm，5μm）或性能相当的色谱柱； b) 流动相：甲醇和0.2%磷酸水溶液，按表1的规定进行梯度洗脱； c) 流速：0.8mL/min； 检测波长：360nm； e) 进样量：10μL； f) 柱温：40℃。 表1梯度洗脱表 甲醇 时间 0.2%磷酸水溶液 min % % 0 25 75 15 58 42 20 80 20 25 100 0 27 25 75 32 25 75 8.2.2标准曲线的制作 取适量标准中间工作溶液（5.4.2），用50%乙醇稀释成系列混合标准工作液（5.4.3），杨梅苷、芦丁、烟花 昔和水仙苷质量浓度范围分别为：0.25mg/L~100.0mg/L、0.15mg/L~600.0mg/L、0.15mg/L~ 300.0mg/L和0.15mg/L100.0mg/L。按照8.2.1规定的色谱条件测定，以标准溶液质量浓度为横 坐标，对应的峰面积为纵坐标，建立标准工作曲线。4种黄酮醇标准溶液色谱图见附录A。 3