ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T19439—2004 H5亚型禽流感病毒NASBA检测方法 Protocol of detecting avian influenza virus subtype H5 using NASBA 2004-02-15实施 2004-02-14发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 19439—2004 前言 高致病性禽流感由正粘病毒科流感病毒属中A型流感病毒引起，世界动物卫生组织（OIE)列为A 类疾病，我国将其列为一类动物疫病 依赖核酸序列的扩增技术（NASBA)检测禽流感病毒的敏感性与经典的鸡胚病原分离方法相当，并 具有检测速度快、特异性强、与鸡胚病原分离方法符合率高、易于操作的特点。 本标准是在综合我国科研成果的基础上，参考OIE《诊断试验和疫苗标准手册》（2000年版），并结 合我国现有动物卫生法规及农业部对禽流感的相关政策和措施制定的 本标准附录A、附录B、附录C为规范性附录，附录D为资料性附录。 本标准由国家质量监督检验检疫总局归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、上海市质量技术监督局、香港基因晶片 开发有限公司。 本标准起草人：单松华、陈家华、谢燕、杨锡全、倪旦红、刘乐庭、刘俊平。 I GB/T19439—2004 H5亚型禽流感病毒NASBA检测方法 1范围 本标准规定了NASBA快速检测H5亚型禽流感病毒技术规范的材料准备、操作方法和结果判定。 本标准适用于禽类、禽肉产品中H5亚型禽流感病毒的快速检测、诊断 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T18936—2003高致病性禽流感诊断技术 SZAG 3原理 NASBA（Nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA，依赖核酸序列的扩增技术）是一项连 核酸聚合酶）和两条寡核苷酸引物。上游引物5末端含有噬菌体T7的依赖于DNA的RNA聚合酶的 启动子序列，下游引物的5末端含有和钉标电化学发光检测探针互补的序列。在扩增步骤中，两个5' 端都整合进扩增序列中，这样既成为产生互补RNA序列的模板，又能特异性结合检测步骤中的ECL 探针。扩增底物与ECL探针形成复合物，携带该复合物的磁珠被电极的表面磁性捕获。电极上的电压 引起电化学发光（ECL）反应。已杂交上的钉标磁珠发出的光和扩增反应产生的RNA扩增产物总量成 比例对应。 4材料准备 4.1试验环境 干净的环境，最好分区。分为核酸提取、核酸扩增和核酸检测三个区。 4.2器材 采用常规的分子生物学器材，包括：一次性手套、移液器（量程5μL到200μL）、枪头、无RNA酶的 1.5mL塑料离心管、1.5mL离心管架、5mL试管架、旋涡振荡器、计时器、高速台式离心机、温度计（精 度土2℃C）、加热器、水浴锅、5mL聚丙烯试管（VWR）、封口膜等。 如果采用ECL方法，需要NucliSens阅读器或者等同的仪器。 如果采用ELISA方法，需要酶标仪。 4.3引物 上游引物 AAT TCTAAT ACGACT CAC TAT AGG GAG AAGG CCAIAA AGA (C/T)AG ACC AGC TA 4.4检测试剂 所有检测试剂在使用前，使其达到室温。 a）裂解缓冲液：5mol/L异硫氰酸胍，10%TritonX-100,10mmol/LTris-HCl,pH8.3； b）冲洗缓冲液：5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/LTris-HCl,pH8.3； c）500mg/mL硅土：500mg/mL盐酸活化的二氧化硅； GB/T19439—2004 (P 洗脱缓冲液：10mmol/LTris-HCl.pH8.3; e) 酶溶液（参见附录A)； f）H5捕捉探针：10mmol/L生物素化寡聚核苷酸； 探针序列为 Biotin-GC(A/G)AGT TC(C/T)CTA GCA CTG GCA AT g）电化学发光法属别检测探针（1omMgenericECLdetectionprobe）：钉标记的DNA寡聚核 苷酸； ECL序列为 GAT GCA AGG TCG CAT ATG AG GT GA(C/T） AAT GAA TG(C/T) ATGGAA h) 仪器调试参照液：10mmol/LNASBACP；1mmol/LTris-HClpH8.3；3mmol/LNASBA ECL; 检测稀释液：15mmol/LTris-HCl,pH8.3； j） 分析缓冲液:50mmol/LTris-HCl,pH8.3;1XPBS(137mmol/LNaCl,2.7mmol/LKCl,10 mmol/L Naz HPO,, 2 mmol/L KH,PO,); k) 清洗液：100mmol/LKOH,10%SDS,10%TritonX-100； 1）无水乙醇。 4.5样品采集、保存、处理 按GB/T18936—2003中2.1进行。 5操作方法 5.1 核酸释放和提取 按以下顺序： a）将0.1mL样品加入盛有0.9mL裂解缓冲液的管中并振荡混合； 振荡混合硅土悬浮液并向每个管中加人50μL； b) c) 振荡混合均匀； d) 室温下温育10min（每2min振荡混合一次，防止硅土沉淀）； e) 在12000r/min下离心裂解缓冲液管30s； 小心移除上清液（不要搅动沉淀）后，向每个管中加人1mL冲洗缓冲液； g) 振荡混合直至管中沉淀重新完全悬浮为止； h) 在12000r/min下离心30s，然后移除上清液； i) 用100%乙醇； j) 最后一次洗涤步骤后，用移液器小心移除残余乙醇； k) 使用加热器在56℃散口干燥硅土10min（用薄纸覆盖每个管避免污染）； 干燥后向每个管加人50μL洗脱缓冲液； m) 振荡试管直至沉淀物再次重新完全悬浮； 56℃温育硅土悬浮液10min以洗脱核酸（5min后开始振荡试管）； 0) 在12 000 r/min 下离心 2 min; p）将5μL核酸上清液转移至新试管，在1h内开始扩增反应。 以上步骤也可采用Qiagen或者等同的其他试剂盒进行。 5.2核酸扩增 按以下顺序： a）向上述5μL核酸[5.1p)]中加入10μL扩增试剂（参见附录A)； b）65℃温育5min; 2 GB/T19439—2004 c) 41℃C温育5min； d) 加入5μL酶溶液（参见附录B），并用手指轻轻扣击试管促使混合均匀； e) 放回试管，并继续在41℃温育5min； f) 将试管稍作离心后，在41℃温育90min； g) 检测扩增产物； h) 在一70℃下保存扩增产物不超过30d。 5. 3 核酸检测 按照以下步骤或用ELISA进行检测： a) 将（Nl)十2）个5mL聚丙烯试管进行编号。试管1作为空白对照； b) 振荡混合，除了试管1外，其余试管各加入20μL杂交溶液（参见附录C)； c) 试管2中加入5uL检测稀释液作为空白对照； d) 其余试管各加5μLRNA扩增产物； e) 封口膜封住所有试管，振荡混合； f) 所有试管41℃温育30min。每10min混合一次； g) 除了试管1外，其余试管各加入0.3mL分析缓冲液； h) 振荡仪器调试参照液直至不透明，然后加0.25mLIRS到试管1； i) 把试管放在转盘式传送盘的适当位置上； j) 运行NucliSens阅读器，对数据进行分析和解释（参见附录D）。 6结果判定 通过大量分析已知阴性对照样品后，确定NASBA/ECL的临界值为0.15X仪器参照溶液的数值。 样品的读数超过临界值时，判为H5亚型禽流感病毒阳性，低于临界值时，判为H5亚型禽流感病毒 阴性。 SAG 1）N为样品数。 3