ICS 59.140.30 Y 46 中华人民共和国国家标准 GB/T 34408—2017 天然皮革牛、羊、猪源性成分定性 PCR检测方法 Detection of bovine,ovine and porcine derived materials in leather by qualitative polymerase chain reaction (PCR) method 2018-04-01实施 2017-09-29发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T34408—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国质量监管重点产品检验方法标准化技术委员会（SAC/TC374)提出并归口。 本标准起草单位：广州质量监督检测研究院、中检华纳（北京）质量技术中心有限公司、中检联盟（北 京质检技术研究院有限公司、陕西科技大学、中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室、国家 皮革制品质量监督检验中心（广州）。 本标准主要起草人：陈宗良、黄巧娟、覃芳芳、罗海英、周惠、郭燕华、屈良、黄宇锋、王学川、柯振华、 吴玉銮、孙世彧。 1 GB/T344082017 天然皮革牛、羊、猪源性成分定性 PCR检测方法 1范围 本标准规定了天然皮革中水牛、黄牛、山羊、绵羊和猪源性成分的聚合酶链式反应（PCR）检测方法 本标准适用于水牛、黄牛、山羊、绵羊和猪皮革动物源性成分的定性检测 本标准不适用于再生革和浸渍水解胶原的人造革（合成革）等材料的检测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T20190—2006饲料中牛羊源性成分的定性检测 定性聚合酶链式反应（PCR)法 GB/T21101—2007动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法PCR方法 3原理 提取天然皮革样品的脱氧核糖核酸（DNA），针对牛、羊、猪物种特异性的内源基因序列设计引物： 通过PCR扩增，获得目标物种的基因序列，根据扩增结果判断皮革所含动物源性成分。 4试剂和材料 4 4.1 所用试剂除特殊指明外，均为分析纯，用水均为GB/T6682中规定一级水 4.2 灭菌水。 4.3 低亚硫酸钠。 4.4 三羟甲基氨基甲烷(Tris)。 4.5 氢氧化钠(NaOH)。 4.6 乙二胺四乙酸钠盐（EDTA-2Na）。 4.7 十二烷基硫酸钠（SDS)。 4.8 乙酸钠。 4.9 氯化钠。 4.10 琼脂糖。 4.11 苯酚（Tris平衡酚）。 4.12 三氯甲烷。 4.13 冰乙酸。 4.14 无水乙醇。 4.15 异戊醇。 1 GB/T34408—2017 4.16 异丙醇。 4.17 盐酸。 4.18 氨水（25%）。 4.19 75%乙醇溶液：取75mL无水乙醇，加水定容至100mL。 4.20 三氯甲烷：异戊醇=24：1（体积比）。 4.21 蛋白酶K（20mg/mL），一20℃保存。 4.22 溴化乙锭（10mg/mL）或等效商业化的其他染料。 4.23 2%（质量浓度）低亚硫酸钠溶液：称取2g低亚硫酸钠，溶于100mL水中。 4.241mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.6和pH8.0)：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）,溶于 800mL水中，冷却至室温，用盐酸调节pH至所需值，加水定容至1L，高压灭菌。 4.250.5mol/LEDTA溶液（pH8.0)：称取186.1gNazEDTA，溶于700mL水中,用NaOH调节pH 至8.0，溶解后加水定容至1L，高压灭菌。 4.265mol/L氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠溶于100mL水中，冷却后，加水定容至200mL。 4.275mol/L氯化钠溶液：称取58.44g氯化钠溶于100mL水中，加水定容至200mL。 4.283mol/L乙酸钠溶液：称取49.21g乙酸钠，溶于120mL水中，用冰乙酸调节pH至5.2.加水定 容至200mL，高压灭菌。 4.29SDS裂解缓冲液：在500mL水中加人100mL1mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.6），100mL 0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液，100mL5mol/L氯化钠溶液，5gSDS完全溶解，加水定容至1L，高 压灭菌。 4.30TE缓冲液：在800mL水中加人10mL1mol/LTris-HCI(pH8.0)缓冲液,2mL0.5mol/L EDTA（pH8.0)溶液，加水定容至1L，高压灭菌。 4.311XTAE电泳缓冲液：取50XTAE（242gTris.57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA溶 液，定容至1L)按比例稀释。 4.32 上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（质量浓度）蔗糖溶液，或等效商品化试剂。 4.33 DNA吸附柱：推荐使用Qiagen品牌DNA吸附柱，也可以使用等效DNA吸附柱。 4.34 DNA提取试剂盒。 4.35 PCR产物回收试剂盒。 4.36 PCR试剂盒，包括Taq酶、dNTPs、PCR体系缓冲液等，按试剂盒要求保存。 4.37 DNA分子量标准品（100bp、200bp、300bp、400bp、500bp等）。 4.38 牛、羊、猪基因组DNA，4℃保存。 SAC 4.39 引物：所需引物信息见表1，一20℃保存。 表1引物信息 引物名称 引物序列 PCR产物大小/bp 目标基因 适用范围 正:5'-AAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTT-3' 内参基因（线粒 内参引物 约240 哺乳动物皮革 反：5'-GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA-3" 体16SRNA基因） 牛特异性 正:5'-GCCATATACTCTCCTTGGTGACA-3" 271 牛内源基因 牛皮革 引物" 反：5'-GTAGGCTTGGGAATAGTACGA-3 山羊特异性 正:5′-TATTAGGCCTCCCCCTTGTT-3" 293 山羊内源基因 山羊皮革 引物 反：5-CCCTGCTCATAAGGGAATAGCC-3 2 GB/T 34408—2017 表1 (续) 引物名称 引物序列 PCR产物大小/bp 目标基因 适用范围 绵羊特异 正:5'-CCTCCAACAGTGAATACTT-3' 202 绵羊内源基因 绵羊皮革 性引物 反：5′-TCCTCCTCATAAAGGAATGGCC-3' 猪特异性 正:5'-GCCTAAATCTCCCCTCAATGGTA-3 212 猪内源基因 猪皮革 引物 反:5'-ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG-3 该引物来源于GB/T20190—2006。 b该引物来源于GB/T20190—2006。 该引物来源于GB/T21101一2007。 仪器与设备 5.1 分析天平：精度土0.01g。 5.2 pH计：精度士0.1。 5.3 高压灭菌锅。 5.4 剪刀。 5.5 恒温水浴箱。 5.6 涡旋震荡器。 5.7 高速冷冻离心机。 5.8 5.9 超微量核酸蛋白分析仪。 5.10 超净工作台。 5.11 PCR热循环仪。 5.12 电泳仪。 5.13 凝胶成像系统。 5.14 全自动核酸电泳分析仪。 6 检测步骤 6.1月 脱色 深色皮革样品宜预先在通风厨中进行脱色处理。将2%低亚硫酸钠溶液（4.23加入烧杯中，水浴加 热至65℃。取2块～3块约5cm×5cm试样放人烧杯中，试样应完全浸没在溶液中，边摇晃边滴入氨 水（4.18），每100mL溶液加入1mL氨水，65℃水浴0.5h～2h，期间摇晃数次，直至试样明显脱色。 自来水冲洗干净，晾干待用。 6.2DNA提取 6.2.1试样DNA提取 试样DNA提取步骤如下： 将经脱色（6.1)处理或未经脱色处理的样品剪碎至小于2mm×2mm，称取1g~2g试样，放 a） 3