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ICS 65.120 B 46 GE 中华人民共和国国家标准 GB/T 22261—2008 饲料中维吉尼亚霉素的测定 高效液相色谱法 Determination of virginiamycin in feeds- High performance liquid chromatography 2008-08-01发布 2008-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22261—2008 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位:农业部饲料质量监督检验测试中心(南京) 本标准主要起草人:冯三令、耿士伟、储瑞武、冯群科、贾书静 1 GB/T22261—2008 饲料中维吉尼亚霉素的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了饲料中维吉尼亚霉素含量的高效液相色谱测定方法, 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中维吉尼亚霉素含量的测定,检出限为 0. 5mg/kg,定量限为2mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682—1992,neqISO3696:1987) GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 3原理 饲料中的维吉尼亚霉素用乙酸乙酯提取出来,提取液经硅胶柱和亲水亲脂平衡型固相萃取柱净化, 在高效液相色谱仪(HPLC)反相柱上分离,用紫外检测器(或二极管阵列检测器)在210nm波长处检 4试剂和溶液 除特殊说明外,所用试剂均为分析纯,水为蒸馏水,色谱用水符合GB/T6682中一级用水规定 4.1乙酸乙酯。 4.2无水硫酸钠。 4.3正已烷。 4.4无水乙酸乙酯-正已烷:将乙酸乙酯和正已烷按体积1+1混合,通过无水硫酸钠脱水。 4.5乙腈。 4.6甲醇。 4.7乙酸铵缓冲溶液(pH4.0):0.05mmol/L。称取3.85g无水乙酸铵,溶解于1000mL水中,用冰 乙酸调节pH至4.0。 4.8甲醇-乙酸铵缓冲溶液:将甲醇和乙酸铵缓冲溶液(4.7)按1:3比例混合,摇匀。 4.940%甲醇-水溶液:将甲醇和水按4十6比例混合,摇匀。 4.10乙睛:色谱纯,用于配制流动相。 4.11磷酸。 4.12流动相:乙十水十磷酸=400+600+1,混匀,用前脱气。 4.13维吉尼亚霉素标准溶液 4.13.1维吉尼亚霉素标准品:维吉尼亚霉素M,和S总和不少于95.0%。 4.13.2维吉尼亚霉素标准贮备液:准确称取维吉尼亚霉素标准品(4.13.1)100mg,置于100mL棕色 1 GB/T22261—2008 量瓶中,用乙睛(4.5)溶解定容,摇匀,该溶液中维吉尼亚霉素浓度为1mg/mL。贮存于4℃冰箱中,有 效期三个月。 4.13.3维吉尼亚霉素标准系列工作液:准确吸取维吉尼亚霉素标准贮备液(4.13.2)置于棕色量瓶中, 中,有效期一周。 5仪器和设备 5.1高效液相色谱仪:配紫外检测器或二极管阵列检测器 5.22 分析天平:感量0.1mg。 5.3涡旋混合器。 5.4走 超声波水浴仪。 5.5离心机:4000r/min。 5.6 氮吹仪:可控温50℃。 5.7[ 固相萃取柱 5.7.1硅胶柱:690mg/3mL。 5.7.2亲水亲脂平衡型固相萃取柱:60mg/3mL 5.8固相萃取装置。 5.9 pH计。 5.100.45μm微孔滤膜。 6试样制备 6.1按GB/T14699.1采样。 6.2选取有代表性饲料样品至少500g,按GB/T20195制备样品。 7测定步骤 7.1提取 称取试样适量(配合饲料、浓缩饲料2g~5g,预混料1g~2g),精确至1mg,置于50mL离心管 中,加2mL水,使试样充分湿润并混匀,加人20mL乙酸乙酯(4.1),加盖,置涡旋混合器上混匀后,置 超声波水浴中超声提取30min。于离心机上以4000r/min离心10min。 准确吸取10mL上层乙酸乙酯清液于另一离心管中,加人5g无水硫酸钠(4.2)和10mL正已烷 (4.3),置涡旋混合器上充分混匀后,于离心机上以4000r/min离心10min,上清液备用。 7.2净化 用2.5mL无水乙酸乙酯-正已烷(4.4)预淋洗活化硅胶柱(5.7.1),将上清液(7.1)小心转移人硅胶 柱内(保持过柱流速不超过2mL/min,且不得抽干),用5mL无水乙酸乙酯-正已烷(4.4)洗涤离心管 中无水硫酸钠,洗涤液一并转移人硅胶柱内,抽干,用2mL乙腈(4.5)淋洗硅胶柱,抽干。 用1mL甲醇(4.6)和1mL乙酸铵缓冲溶液(4.7)预淋洗活化亲水亲脂平衡型固相萃取柱 (5.7.2),将抽干的硅胶柱安装在亲水亲脂平衡型固相萃取柱(5.7.2)的上面,用5mL甲醇-乙酸铵缓冲 2mL/min。淋洗完毕后,弃去硅胶柱,用5mL40%甲醇-水溶液(4.9)淋洗亲水亲脂平衡型固相萃取柱 (5.7.2),弃去淋洗液。最后用5mL甲醇(4.6)进行洗脱,收集洗脱液,于50℃C氮吹仪上蒸发至干,用 0.5mL~5mL的流动相(4.12)溶解残渣,过0.45um微孔滤膜,供上机测定。 7.3色谱条件 7.3.1色谱柱:Cis柱,长150mm,内径4.6mm,粒径5μm,或相当者。 2 GB/T22261—2008 7. 3. 2 2柱温:室温。 7.3.3流动相:同4.12。 7.3.4流速:1.0 mL/min。 7.3.5检测器:紫外检测器(或二极管阵列检测器),检测波长210nm。 7.3.6进样体积:20μL。 7.4定量测定 按上述色谱条件,分别将维吉尼亚霉素标准系列工作液(4.13.3)及试样溶液(7.2)上机测定,根据 维吉尼亚霉素MI和S峰面积加和值,用外标法定量。 7.5结果计算 试样中维吉尼亚霉素的含量(X)以质量分数(mg/kg)表示,按式(1)计算: mXV2 式中: X-一试样中维吉尼亚霉素的含量,单位为毫克每千克(mg/kg); 试样溶液中M,和S色谱峰面积加和值对应的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL); Vi- 加人试样中的乙酸乙酯总体积,单位为毫升(mL); 最终溶解残渣用流动相的体积,单位为毫升(mL); m—试样质量,单位为克(g); V2一—移取的乙酸乙酯体积,单位为毫升(mL)。 结果用平行测定的算术平均值表示,保留三位有效数字。 8 精密度 在重复性试验条件下两次平行测定结果的相对偏差不大于10%。

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