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ICS 67.120 x 04 中华人民共和国国家标准 GB/T21317—2007 动物源性食品中四环素类兽药残留量 检测方法 液相色谱-质谱/质谱法 与高效液相色谱法 Determination of tetracyclines residues in food of animal origin- LC-MS/MS method and HPLC method 2008-04-01实施 2007-10-29发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 21317—2007 前言 本标准的附录A、附录B和附录 C为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院 本标准主要起草人:岳振峰、谢丽琪、叶卫翔、吉彩霓、林秀云、邱月明、赵凤娟、陈沛金、周亚敏。 本标准系首次发布。 GB/T 21317—2007 动物源性食品中四环素类兽药残留量 检测方法液相色谱-质谱/质谱法 与高效液相色谱法 SAG 1范围 本标准规定了动物源性食品中四环素类兽药残留量检测的制样方法、高效液相色谱检测方法和液 相色谱-质谱/质谱确证方法。 本标准适用于动物肌肉、内脏组织、水产品、牛奶等动物源性食品中二甲胺四环素、土霉素、四环素、 去甲基金霉素、金霉素、甲烯土霉素、强力霉素7种四环素类兽药残留量的高效液相色谱测定和二甲胺 四环素、差向王霉素、王霉素、差向四环素、四环素、去甲基金霉素、差向金霉素、金霉素、甲烯土霉素、强 力霉素10种四环素类药物残留量的液相色谱-质谱/质谱测定。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准, 3原理 试样中四环素族抗生素残留用0.1mol/LNazEDTA-Mcllvaine缓冲液(pH=4.0士0.05)提取,经 过滤和离心后,上清液用HLB固相萃取柱净化,高效液相色谱仪或液相色谱电喷雾质谱仪测定,外标 峰面积法定量。 4试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇:高效液相色谱纯。 4.2乙睛:高效液相色谱纯。 4.3乙酸乙酯。 4.5 三氟乙酸。 4.6 柠檬酸(C,H.O·H,O)。 4.7 磷酸氢二钠(Na,HPO·12H,O)。 4.8柠檬酸溶液:0.1mol/L。称取21.01g柠檬酸(4.6),用水溶解,定容至1000mL。 4.9磷酸氢二钠溶液:0.2mol/L。称取28.41g磷酸氢二钠(4.7),用水溶解,定容至1000mL。 4.10Mcllvaine缓冲溶液:将1000mL0.1mol/L柠檬酸溶液(4.8)与625mL0.2mol/L磷酸氢二 钠溶液(4.9)混合,必要时用氢氧化钠或盐酸调节pH=4.0士0.05。 4.11NazEDTA-Mcllvaine缓冲溶液:0.1mol/L。称取60.5g乙二胺四乙酸二钠(4.4)放人 1625mLMcllvaine缓冲溶液(4.10)中,使其溶解,摇匀。 4.12甲醇+水(1+19):量取5mL甲醇(4.1)与95mL水混合。 1 GB/T21317—2007 4.13甲醇+乙酸乙酯(1十9:量取10mL甲醇(4.1)与90mL乙酸乙酯(4.3)混合。 4.14OasisHLB固相萃取柱:60mg,3mL,或相当者。使用前分别用5mL甲醇和5mL水预处理, 保持柱体湿润。 4.15三氟乙酸水溶液(10mmol/L):准确吸取0.765mL三氟乙酸于1000mL容量瓶中,用水溶解并 定容至刻度。 4.16甲醇+三氟乙酸水溶液(1十19):量取50mL甲醇(4.1)与950mL三氟乙酸水溶液(4.15)混合。 4.17标准物质:二甲胺四环素(minocycline,CAS:10118-90-8),土霉素(oxytetracycline, CAS:6153-64-6),四环素(tetracycline,CAS:60-54-8),去甲基金霉素(demeclocycline, CAS:127-33-3),金霉素(chlortetracycline,CAS:57-62-5),甲烯王霉素(methacycline, CAS:914-00-1),强力霉素(doxycycline,CAS:564-25-0),差向四环素(4-epitetracycline, CAS:64-75-5),差向土霉素(4-epioxytetracycline,CAS:35259-39-3),差向金霉素(4-epichlortetracy cline,CAS:14297-93-9)。纯度均大于等于95%。 4.18标准溶液 4.18.1标准储备溶液:准确称取按其纯度折算为100%质量的二甲胺四环素、土霉素、四环素、去甲基 金霉素、金霉素、甲烯土霉素,强力霉素、差向土霉素、差向四环素和差向金霉素各10.0mg,分别用甲醇 月以上。 4.18.2混合标准工作溶液:根据需要,用甲醇十三氟乙酸水溶液(4.16)将标准储备溶液(4.18.1)配 制为适当浓度的混合标准工作溶液。混合标准工作溶液应使用前配制。 5仪器 5.1液相色谱串联四极杆质谱仪或相当者,配电喷雾离子源。 5.2高效液相色谱仪:配二极管阵列检测器或紫外检测器。 5.3分析天平:感量0.1mg,0.01g。 5.4旋涡混合器。 5.5低温离心机:最高转速5000r/min,控温范围为一40℃至室温。 5.6吹氮浓缩仪。 5.7 固相萃取真空装置。 5.8pH计:测量精度±0.02 5.9组织捣碎机。 5.10超声提取仪。 6样品制备与贮存 制样操作过程中应防止样品受到污染或残留物含量发生变化。 6.1动物肌肉、肝脏、肾脏和水产品 于一18℃以下冷冻存放 6.2牛奶样品 存放。 2 GB/T 21317—2007 7测定步骤 7.1提取 7.1.1动物肝脏、肾脏、肌肉组织、水产品 称取均质试样5g(精确到0.01g),置于50mL聚丙烯离心管中,分别用约20mL、20mL、 10mL0.1mol/LEDTA-Mcllvaine缓冲溶液(4.11)冰水浴超声提取三次,每次旋涡混合1min,超声 提取10min,3000r/min离心5min(温度低于15℃),合并上清液(注意控制总提取液的体积不超过 50mL),并定容至50mL,混匀,5000r/min离心10min(温度低于15℃),用快速滤纸过滤,待净化。 7.1.2牛奶 称取混匀试样5g(精确到0.01g),置于50mL比色管中,用0.1mol/LEDTA-Mcllvaine缓冲溶 液(4.11)溶解并定容至50mL,旋涡混合1min,冰水浴超声10min,转移至50mL聚丙烯离心管中, 冷却至0℃~4℃,5000r/min离心10min(温度低于15℃),用快速滤纸过滤,待净化。 7.2净化 准确吸取10mL提取液(相当于1g样品)以1滴/s的速度过HLB固相萃取柱(4.14),待样液完 全流出后,依次用5mL水和5mL甲醇十水(4.12)淋洗,弃去全部流出液。2.0kPa以下减压抽干 5min,最后用10mL甲醇十乙酸乙酯(4.13)洗脱。将洗脱液吹氮浓缩至干(温度低于40℃),用 渣,过0.45um滤膜,待测定。 7.3测定 7.3.1液相色谱-质谱/质谱法 7.3.1.1液相色谱条件 色谱柱:InertsilC8-3,5um,150mm×2.1mm(内径),或相当者; b) 流动相:甲醇(4.1)+10mmol/L三氟乙酸(4.15),梯度洗脱(梯度时间表见表1); 表1分离10种四环素类药物的液相色谱洗脱梯度 时间/min 甲醇/% 10mmol/L三氟乙酸/% 5.0 95.0 5. 0 30. 0 70. 0 10.0 33.5 66.5 12. 0 65.0 35. 0 17.5 65.0 35.0 18.0 5. 0 95.0 25.0 5.0 95.0 流速:300μL/min; c) d) 柱温:30℃; e)i 进样量:30μL。 7.3.1.2质谱条件 离子化模式:电喷雾电离正离子模式(ESI十);质谱扫描方式:多反应监测(MRM):分辨率:单位分 辨率;其他参考质谱条件见附录A。 7.3.1.3定性测定 7.3.1.3.1保留时间 待测样品中化合物色谱峰的保留时间与标准溶液相比变化范围应在2.5%之内。 3

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