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ICS 65.120 B 46 GE 中华人民共和国国家标准 GB/T 21108—2007 饲料中氯霉素的测定 高效液相色谱串联质谱法 Determination of choramphenicol in feeds- High performance liquid chromatography tandem mass spectometry 2007-10-24发布 2008-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 21108—2007 前言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、国家饲料质量监督检验中心 (北京)。 本标准主要起草人:赵根龙、高牛、宋荣、张发旺 本标准首次发布。 GB/T21108—2007 饲料中氯霉素的测定 高效液相色谱串联质谱法 1范围 本标准规定了测定饲料中氯霉素的高效液相色谱串联质谱法(LC/MS/MS)。 本标准适用于配合饲料和预混合饲料中氯霉素的测定,其最低定量限为10ug/kg,最低检测浓度 为5 μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样(GB/T14699.1—2005,ISO6497:2002,IDT) 3原理 饲料中的氯霉素用乙酸乙酯提取,取部分提取液用氮气吹干。残渣溶于甲醇氯化钠溶液,用正已烷 萃取除去脂溶性杂质。再将氯霉素回提至乙酸乙酯,吹干。用乙腈水溶液溶解,过C1s小柱净化。最后 用LC/MS/MS法分离、检测和定量。 4试剂与材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂。水为蒸馏水,色谱用水符合GB/T6682的一级用水的规定。 4.1乙腈:色谱纯。 4.2甲醇:色谱纯。 4.3乙酸乙酯。 4.4正已烷。 4.5 三氯甲烷。 4.6 乙睛溶液 4.6.1乙睛溶液I:取5.0mL乙腈加水95mL。 4.6.2乙腈溶液I:吸取乙睛50mL加水50mL。 4.7氯化钠。 4.8氯化钠溶液:浓度为40g/L,称取40.0g氯化钠(4.7)加水溶解定容到1000mL。 4.10氯霉素标准品:纯度大于98%。 4.11氯霉素标准液 4.11.1标准贮备液:准确称取100mg士0.1mg氯霉素标准品(4.10)用乙睛溶解,定容到100mL,该 溶液氯霉素浓度为1mg/mL,密封贮于冰箱内,有效期为一年。 4.11.2标准中间液I:吸取标准贮备液(4.11.1)5.00mL,于50mL容量瓶内,用乙睛溶液Ⅱ(4.6.2) 1 GB/T211082007 (4.6.2)定容至100mL,该溶液氯霉素浓度为1.0μg/mL,密封于冰箱内,有效期为3个月。 4.11.4标准中间液Ⅲ:吸取标准中间液Ⅱ(4.11.3)10.00mL于100mL容量瓶内,用乙睛溶液IⅡI (4.6.2)定容至100mL。该溶液氯霉素浓度为100ng/mL,密封贮于冰箱内,有效期为7天。 4.11.5标准工作溶液:用移液管分别吸取标准中间液Ⅲ(4.11.4)1、5、10、50mL于4个100mL容量 瓶内,用乙睛溶液Ⅱ(4.6.2)定容至刻度。该溶液氯霉素浓度为1.0、5.0、10、50ng/mL 4.12Cis固相萃取(SPE)小柱:载体200mg、承载液体体积3mL。 5仪器 5.1离心机:转速为4000r/min以上。 5.2超声波提取器。 5.3涡旋混合器。 5.5液相色谱串联质谱仪:配备电喷雾离子源(ESI)的液相色谱串联质谱仪。 6试样的制备 筛,混合均匀,装入磨口瓶中备用。 7分析步骤 7.1提取 称取一定量的试样(配合饲料5g,预混合饲料1g,精确至0.001g),置于50mL塑料离心管内 (5.4)加40.0mL乙酸乙酯(4.3)盖好密封盖于涡旋混合器上混合2min。放入超声波提取器中提取 取上清液20mL,于50℃加热器上用氮气吹至近干,待净化。 7.2净化 7.2.1液-液分配净化 用氯化钠甲醇溶液(4.9)2、1、1mL分三次溶解残渣(7.1),均转移到同一个10mL具塞试管内。 加4mL正已烷,涡旋混合2min,放人离心机于4000r/min离心4min,弃去上层正已烷,重复上述操 作一次。水相加乙酸乙酯(4.3)3ml,涡旋混合2min,放入离心机4000r/min离心4min。吸取上层 乙酸乙酯,水相置另一个5mL具塞试管内,加乙酸乙酯(4.3)2mL重复上述操作一次。吸取上层乙酸 乙酯,置于上述同一个水相具塞试管内,置加热器上50℃下,用氮气吹干。用3mL乙睛溶液I(4.6.1) 溶解,待SPE小柱净化。 7.2.2SPE柱净化 每一试样各准备一支C1s小柱(4.12),顺序用5mL甲醇,5mL三氯甲烷,5ml甲醇和10mL水预 清洗C18柱。将样液(7.2.1)过此小柱(流速<1mL/min),用5mL乙睛溶液I(4.6.1)淋洗,最后用 3mL乙睛溶液Il(4.6.2)洗脱,收集洗脱液于10mL具塞试管内。洗脱液加5mL乙酸乙酯涡旋混合 1min,2000r/min离心,下层水相用乙酸乙酯重复萃取一次,合并乙酸乙酯提取液于5mL具塞试管 内。在加热器上(50℃)用氮气吹干,用2mL乙睛溶液Ⅱ(4.6.2)溶解,调节试样溶液浓度,使上机浓度 不高于100ng/mL。 7.3测定 7.3.1液相色谱条件 色谱柱:Cis柱,柱长150mm,柱内径2.1mm,粒度3.5um或性能类似的分析柱。 2 GB/T 21108—2007 柱温:室温。 流动相组成:乙腈十水=30+70(Vi+V2)。 流动相流速:250L/min。 进样量:10μL。 7.3.2质谱条件 电喷雾离子源(ESI)负离子方式检测。 喷雾电压:3500V。 壳气流速:0.68L/min。 辅助气流速:3.6L/min。 毛细管温度:300℃。 母离子321,二级子离子为257、152、121。碰撞电压如表1: 表1氯霉素的子离子及其碰撞电压 母离子 子离子 碰撞压力/eV 321 257 23 321 152 18 321 121 12 7.3.3试样的测定 离子(m/z)257、152、121进行定性,其相对丰度比见表2。以152作为定量子离子,并用氯霉素标准工 作液做单点或多点校准,以峰面积比较进行定量计算。 表2氯霉素的子离子及相对丰度比 子离子(m/z) 257 152 121 相对丰度/% 100 90±18 8±4 8结果计算与表述 8.1结果计算 试样中氯霉素的含量X,以质量分数微克每千克(μg/kg)表示,单点校准时可用式(1)计算: P, XVi XcXV,Xn ..(1) PXmXV3 式中: 试样溶液对应的色谱峰面积响应值; Vi 加人定容液的体积,单位为毫升(mL); 氯霉素标准溶液的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); V2 氯霉素标准溶液的进样体积,单位为微升(μL); 稀释倍数; n P1 氯霉素标准溶液对应的色谱峰面积响应值; 试样质量,单位为克(g); m Va 试样溶液的进样体积,单位为微升(μL)。 多点校准时可用式(2)计算: ·(2 ) m XVs 3

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