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ICS 65.120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 21107—2007 动物源性饲料中马、驴源性成分 定性检测方法 ,PCR方法 Identification of horse and donkey derived materials in animal-originated feedstuffs-PCR method 2007-10-24发布 2008-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 21107—2007 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。 和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国青岛出人境检验检疫局 本标准主要起草人:宗卉、曾少灵、温燕辉、徐宇梁、高宏伟、陈颖、吴亚君、郑秋月、曹际娟 本标准首次发布。 GB/T21107—2007 动物源性饲料中马、驴源性成分 定性检测方法PCR方法 1范围 为0.1%(质量分数)。 本标准适用于动物源性饲料中马、驴源性成分的定性检测 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样(GB/T14699.1—2005,ISO6497:2002,IDT) SN/T1193基因检验实验室技术要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction;PCR 用于扩增位于两段已知序列之间DNA(deoxyribonucleosideaacid,脱氧核糖核酸)的方法。模板 别与模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火,接着在DNA聚合酶的催化下以4种dNTP (deoxyribonucleosidetriphosphate,脱氧核苷酸三磷酸)为底物,使退火引物得以延伸,如此反复变性、 退火和DNA合成这一循环,使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增,经25个~30个 扩增循环,扩增倍数达到约10°。 4原理 利用裂解液破碎细胞,三氯甲烷抽提蛋白质,异丙醇沉淀得到DNA;以提取的DNA为模板进行 PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物;应用限制性内切酶酶切反应进行确证。 5试剂和材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂,实验用水符合GB6682的要求 5.1马、驴源性成分检测用引物(对)序列为: 5'tgccacagttggatacatcaac 3' 5'attgagattaggcgattgtt 3" 5.2TaqDNA聚合酶(Thermusaquaticu,水生栖热菌)。 5.3限制性内切酶:Sau3A酶,AluI酶。 5.4dNTPs:dATP(deoxyadenosinetriphosphate,脱氧腺苷三磷酸)、dTTP(deoxythymidinetriphos 1 GB/T21107—2007 phate,脱氧胸苷三磷酸)、dCTP(deoxycytidinetriphosphate,脱氧胞苷三磷酸)、dGTP(deoxyguanosine triphosphate,脱氧鸟苷三磷酸)。 5.5琼脂糖:电泳纯。 5.6溴化乙锭。 5.7三氯甲烷。 5.8异丙醇。 5.970%乙醇。 5.10分子量标准品(100bp~2000bp)(bp:basepair,碱基对)。 5.11裂解液:1%CTAB(cetyltrithylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵),0.05mol/LTris- HCl(pH8.0)[Tris-:tris(hydroxymethyl)aminomethane,三(羟甲基)氨基甲烷]0.7mol/LNaCl, 0.0lmol/LEDTA(pH8.0)(ethylenediaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸)。 5.12TE缓冲液(Tris-HCl、EDTA缓冲液):10 mmol/LTris-HCl(pH8.0),1 mmol/LEDTA (pH8. 0) . 5.1310XPCR缓冲液:100mmol/LKCl,160mmol/L(NH,),SO4,20mmol/LMgSO4,200mmol/L Tris-HCl(pH8.8),1%TritonX-1oo(t-octylphenoxypolyethoxyethanol,辛基苯氧基聚乙氧乙醇), 1mg/mLBSA(bovine serum albumin,牛血清蛋白)。 5.14电泳缓冲液:Tris54g,硼酸27.5g,0.5mol/LTE缓冲液(pH8.0)20mL,加蒸馏水至1000mL;使 用时10倍稀释。 5.15溴化乙锭贮存液:10mg/mL水溶液。 5.16加样缓冲液:0.25%溴酚蓝,40%(质量浓度)蔗糖。 5.17 酶切缓冲液:10mmol/LTris-HCI(pH7.5),10mmol/LMgCl2,50mmol/LNaCl,0.1mg/mLBSA。 6仪器设备 6.1DNA热循环仪。 6.2离心机(离心力12000g)。 6.3核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.4微量移液器(0. 1 μL~2 μL,0. 5μL~10 μL,2 μL~20 μL,10 μL~100 μL,20 μL~200 μL, 200 μL~1 000 μL)。 6.5电泳仪。 6.6紫外检测仪。 6.7 pH计。 6.8恒温水浴锅。 6. 9 天平(感量0.01g)。 7试样选取与制备 按照GB/T14699.1采样,将实验室样品粉碎,充分混合均匀后待用。 8检验步骤 8.1样品的总DNA提取 称取适量饲料(饲料粒度为20目称取200mg,60目称取100mg,100目称取50mg)于1.5mL离 心管中,加人600μL~800L裂解液,65℃30min,期间不时振荡混勺;12000g离心5min;转移上清于 洁净离心管中,加400μL三氯甲烷十异戊醇(24+1),混匀;12000g离心5min,取上清液;加0.8倍体 积异丙醇,沉淀;12000g离心5min,弃上清液;70%乙醇洗涤一次,晾干;加人50μLTE,溶解沉淀 2 GB/T 21107—2007 也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。 8.2DNA浓度和纯度的测定 取5μLDNA溶液,用ddH,O(doubledistilledwater,双蒸水)稀释至1mL,使用核酸蛋白分析仪 或紫外分光光度计检测260nm和280nm处的吸光值A260和Az80。DNA的浓度按式(1)计算: c=AXNX50/1000 ..(1) 式中: DNA浓度,单位为微克每微升(μg/μL); A——260nm处的吸光值; N——核酸稀释倍数。 当A260/A280比值为1.7~1.9之间时,适宜于PCR扩增。 8.3PCR扩增 50μL反应体系:10×PCR缓冲液5μL、dNTPs(5mmol/L)1μL、引物对(5μmol/L)各2μL、Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL、模板DNA(100ng±50ngDNA)10μL、ddH,O31.5μL。 反应条件:PCR反应条件随仪器不同略有改变。94℃预变性1min~3min。94℃变性30s~60s, 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含马或驴源性成分的样品作阳性对照, 8.4PCR扩增产物电泳检测 取2.0g琼脂糖,于100mL电泳缓冲液中加热,充分熔化,加人溴化乙锭贮存液至终浓度为 0.5μg/mL,制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液,使液面刚刚没过凝胶。将5μL~8μLPCR扩增产物 分别和适量加样缓冲液混合,点样。9V/cm恒压电泳,至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。紫外检测仪 下观察电泳结果并记录。 8.5限制性内切酶酶切及产物电泳检测 PCR扩增产物电泳检测结果阳性,进行限制性内切酶酶切反应。 反应体系(50μL):Sau3A酶1μL(10U/μL),酶切缓冲液5μL,PCR扩增产物20μL,ddHzO 24μL。充分混匀反应液,37℃水浴1h,65℃水浴5min终止酶切反应。酶切完成后电泳,方法见8.4。 9结果判断与表述 9.1PCR扩增产物电泳检测结果 马和驴源性成分的PCR扩增产物大小均为294bp(序列参考附录A)。 9.2限制性内切酶酶切电泳检测结果 马源性成分的PCR扩增产物经Sau3A限制性内切酶酶切后,片段大小为226bp和68bp。 驴源性成分的PCR扩增产物经AluI限制性内切酶酶切后,片段大小为113bp和181bp。 9.3结果表述 PCR扩增产物电泳检测结果阴性者判为不含有马、驴源性成分,表述为未检出马、驴源性成分 PCR扩增产物电泳检测结果阳性,限制性内切酶酶切产物片段大小正确,判为含有马或驴源性成 分,表述为检出马或驴源性成分。 10 检测过程中防止交叉污染的措施 按照SN/T1193执行。 11废弃物处理 检测过程中的废弃物,收集后在焚烧炉中焚烧处理。

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GB-T 21107-2007 动物源性饲料中马、驴源性成分定性检测方法 PCR方法 第 1 页 GB-T 21107-2007 动物源性饲料中马、驴源性成分定性检测方法 PCR方法 第 2 页 GB-T 21107-2007 动物源性饲料中马、驴源性成分定性检测方法 PCR方法 第 3 页
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