ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 20742—2006 牛甲状腺和牛肉中硫嘧啶、甲基硫脲嘧啶、 正丙基硫脲嘧啶、它巴唑、巯基苯并咪唑 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Method for the determination of 2-thiouracil,methyl thiouracil,propyl thiouracil,tapazole and 2-mercaptobenzimidazole residues in bovine thyroid and muscles- LC-MS-MS method 2006-12-31发布 2007-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 20742—2006 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：庞国芳、张进杰、曹彦忠、郭彤彤、范春林、李学民、刘永明、曹亚平、刘小茂。 本标准系首次发布的国家标准 GB/T20742—2006 牛甲状腺和牛肉中硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶、 正丙基硫脲嘧啶、它巴唑、巯基苯并咪唑 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了牛甲状腺和牛肉中硫脲嘧啶（2-thiouracil）、甲基硫脲啶（methylthiouracil）、止内 基硫脲嘧啶（propylthiouracil）、它巴唑（tapazole）、巯基苯并咪唑（2-mercaptobenzimidazole）残留量液 相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于牛甲状腺和牛肉中硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶、正丙基硫脲嘧啶、它巴唑、巯基苯并咪唑 残留量的测定。 苯并咪唑均为2μg/kg。 2规范性引用文件 SZC 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6379.1 测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.12004,ISO5725-1:1994,IDT) 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2一2004，ISO5725-2：1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987） 3原理 试样中残留的硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶、正丙基硫脲嘧啶、它巴唑、硫基苯并咪唑用乙酸乙酯提取， 氨基固相萃取柱净化后浓缩，用4-氯-7-苯并呋咱衍生化，再用固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱 检测。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2乙腈：色谱纯。 4.3乙酸乙酯：色谱纯。 4.4 磷酸氢二钠,NazHPO·12HO。 4.5磷酸二氢钾,KH,PO4。 4.6乙酸。 4.7浓盐酸。 4.8氢氧化钠。 GB/T 20742—2006 4.9三氯甲烷。 4. 10 正已烧。 4.114-氯-7-苯并呋咱（4-chloro-7-nitrobenzo-2-furazanNBF-CI)，CH,CIN.O：含量≥99%。 4.12巯基乙醇：分析纯。 4.13乙二胺四乙酸二钠.C1oH4N2O.Na2·2H,O。 4.14无水硫酸钠：使用前650℃灼烧4h。 4.15磷酸盐缓冲溶液：pH=8,0.2mol/L。称取67.7g磷酸氢二钠（4.4)和1.5g磷酸二氢钾（4.5)， 用水溶解，定容至1000mL。 4.16盐酸溶液：0.2mol/L。量取17mL浓盐酸（4.7），用水定容至1000mL。 4.17氢氧化钠溶液：1mol/L。称取40g氢氧化钠（4.8）,用水溶解，定容至1000mL。 现配。 4.19乙二胺四乙酸二钠溶液：0.1mol/L。称37.2g乙二胺四乙酸二钠（4.13)溶于1000mL水中。 4.20洗脱液：含3%乙酸的甲醇和三氯甲烷（15+85）混合溶液。吸取3mL乙酸（4.6）于100mL容 量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀。吸取该溶液15mL于100mL容量瓶中，用三氯甲烷（4.9）定容至刻 度，混匀。 4.21定容液：含0.3%乙酸的乙晴水溶液。吸取0.3mL乙酸和15mL乙晴（4.2）于100mL容量瓶 中，用水定容至刻度，混匀。 4.22标准物质：硫脲嘧啶（2-thiouracil,TU）、甲基硫脲嘧啶（Methylthiouracil,MTU）、正丙基硫脲嘧 啶（propylthiouracil，PrTU）、它巴唑（Tapazole，TAP）、巯基苯并咪唑（2-mercaptobenzimidazole，MBI）， 纯度≥99%。 4.23内标标准物质：甲基巯基苯并咪唑（2-methoxethox-mercaptobenzimidazole，MEMBI），纯度 ≥99%。 4.24标准储备溶液：1.0mg/mL。称取适量的硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶、正丙基硫脲嘧啶、它巴唑、疏 基苯并咪唑标准物质（4.22），分别用甲醇配成1.0mg/mL的标准储备液。避光一18℃保存，可使用 6个月。 4.25混合标准工作溶液：0.1ug/mL。吸取每种适量标准储备溶液（4.24），用甲醇稀释成0.1μg/mL 的混合标准工作溶液，避光一18℃保存，可使用3个月。 1.0mg/mL的标准储备液，避光一18℃保存，可使用6个月。 4.27内标标准工作溶液：0.1ug/mL。吸取内标标准储备溶液（4.26）.用甲醇稀释成0.1μg/mL的 内标标准工作溶液，避光一18℃保存，可使用3个月。 4.28Sep-ParkAminoPropyl固相萃取柱或相当者：500mg，3mL。使用前用20mL正已烷预处理， 保持柱体湿润。 4.29OasisHLB固相萃取柱或相当者：60mg，3mL。使用前分别用5mL甲醇和10mL水预处理， 保持柱体湿润。 4.300.2μm滤膜。 5仪器 SAC 5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。 5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g。 5.3液体混匀器。 5.4固相萃取装置。 2 GB/T20742—2006 5.5氮气吹干仪。 5.6 恒温振荡水浴。 5.7真空泵：真空度应达到80kPa。 5.8 微量注射器：25μL，100μL。 5.9 棕色具塞离心管：25mL，50mL。 5.10pH计：测量精度±0.02pH单位 5.11贮液器：50mL。 5.12 离心机：转速大于4000r/min。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 6.1.1牛甲状腺样品的制备 取50g～100g阴性牛甲状腺组织，加入3倍质量的干冰，用组织捣碎机绞碎后，使干冰在室温下蒸 发，备用。 6.1.2牛肌肉组织用组织捣碎机绞碎，分出0.5kg作为试样备用。 6.2试样保存 制备好的试样置于一18℃冰柜中避光保存。 7测定步骤 SAC 7.1混合基质标准校准溶液的制备 7.1.1样品称取 5.0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL。再分别加人适量内标标准工作溶液（4.27），使其浓度均为2.0 ng/mL。 7.1.2提取和初次净化 分别往上述离心管中加人10mL乙酸乙酯（4.3）,3g无水硫酸钠（4.14），20μL巯基乙醇（4.12）， 30μl0.1mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（4.19），均质15s，再用5mL乙酸乙酯洗涤均质器刀头，二者 合并，4000r/min离心5min，取上清液并在氮气吹干仪（5.5）上50℃水浴吹干。用2mL乙睛溶解残 余物，加入3mL正已烷（4.10）振荡1min，4000r/min离心5min，吸取并弃掉正已烷，再加3mL正已 烷重复一次。剩余溶液在氮气吹干仪上50℃水浴吹干。用0.5mL三氯甲烷溶解残余物，边摇边在超 声波水浴中停留几秒钟，加入3mL正已烷，涡旋混匀，倒人下接预处理好的Sep-ParkAminoPropyl固 相萃取柱（4.28)的贮液器（5.11)中，在固相萃取装置（5.4)上使样液以小于2mL/min的流速通过Sep ParkAminoPropyl固相萃取柱，待样液全部通过固相萃取柱后用10mL正已烷淋洗固相萃取柱，弃去 全部流出液。用5mL洗脱液（4.20）洗脱到25mL棕色离心管（5.9）中并在氮气吹干仪上50℃水浴 吹干。 7.1.3衍生化和再次净化 用5mL0.1mol/LpH=8的磷酸盐缓冲溶液（4.15）溶解上述残留物，加人0.3mL衍生剂 （4.18），涡旋混合1min，在50℃恒温振荡水浴避光反应3h。衍生液放至室温，用0.2mol/L盐酸溶液 （4.16)调节pH值在3～4之间，溶液倒入下接OasisHLB固相萃取柱（4.29）的贮液器中，在固相萃取 装置上使样液以小于2mL/min的流速通过OasisHLB柱，待样液全部通过固相萃取柱后用10mL水 洗固相萃取柱，弃去全部流出液。用真空泵（5.7)在65kPa负压下抽干OasisHLB固相萃取柱10min。 再用5mL乙酸乙酯洗脱被测物于25mL棕色离心管中，在氮气吹干仪上50℃水浴吹干，残余物加