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ICS 07. 100. 30 C 53 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T19915.6—2005 猪源链球菌通用荧光PCR检测方法 Method of the real-time PCR for the detection of Streptococcus suis 2005-09-27发布 2005-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T19915.6—2005 前言 本标准的附录A是规范性附录,附录B是资料性附录。 本标准由国家标准化管理委员会提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中国兽医药品监察所 本标准主要起草人:张鹤晓、宋立、高志强、宁宜宝、周琦、乔彩霞、杨承槐、吴丹、谷强。 本标准系首次发布的国家标准。 GB/T19915.6—2005 猪源链球菌通用荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了猪源链球菌通用荧光PCR检测方法。 本标准适用于增菌培养物、疑似病料及生猪拭子、猪组织样品中猪源链球菌的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T19438.1—2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 3缩略语 本标准采用下列缩略语: 荧光PCR荧光聚合酶链式反应 Ct 值 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环圈数 DNA 脱氧核糖核酸 TaqDNA聚合酶 PBS 磷酸盐缓冲生理盐水 4原理 采用TaqMan方法,在比对猪源链球菌16SrDNA基因序列的基础上,设计针对该基因的特异性引 物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5端标记FAM荧光素为报告荧光基团(用R表示), 3端标记TAMRA荧光素为率灭荧光基团(用Q表示),它在近距离内能吸收5端荧光基团发出的荧光 信号。PCR反应进入退火阶段时,引物和探针同时与目的基因片段结合,此时探针上R基团发出的荧 光信号被Q基团所吸收,仪器检测不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时,Taq酶的5→3'的外切核 酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来,所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接 收。随着PCR反应的循环进行,PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。 5猪源链球菌通用荧光PCR检测实验室的标准化设置与管理 猪源链球菌通用荧光PCR检测实验室的标准化设置与管理见GB/T19438.1一2004中附录C。 6试剂和材料 6.1试剂 除另有说明,所用试剂均为分析纯。 6.1.1无水乙醇:一20℃预冷。 6.1.275%乙醇:用新开启的无水乙醇和无DNA酶的灭菌纯化水配制,一20℃预冷 6.1.30.01mol/LpH7.2的PBS:配方见附录A,(121土2)℃、15min高压灭菌冷却。 1 GB/T19915.6—2005 6.1.4猪源链球菌通用荧光PCR检测试剂盒!:试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录B。 6.2仪器设备 6.2.1高速台式冷冻离心机:最大转速13000r/min以上。 6.2.2荧光PCR检测仪、计算机。 6.2.32℃~8℃冰箱和-20℃冰箱 6.2.5组织匀浆器。 6.2.6混匀器。 7样品的采集与前处理 采样过程中样本不得交叉污染,采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。 7.1取样工具 7.1.1棉拭子、剪刀、镊子、研钵、Eppendorf管。 7.1.2所有上述取样工具应经(121士2)℃、15min高压灭菌并烘干或经160℃干烤2h。 7.2采样方法 7.2.1生猪拭子样品 咽喉拭子采样,采样时要将拭子深入喉头及上聘来回刮3次~5次,取咽喉分泌液。 7.2.2扁桃体、内脏或肌肉样品 用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0g于研钵中充分研磨,再加5.0mLPBS混匀,然后将组织 悬液转入无菌Eppendorf管中,编号备用。 7.2.3血清或血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中,编号备用。 7.3存放与运送 采集或处理的样本在2℃~8℃条件下保存应不超过24h;若需长期保存,须放置一70℃冰箱,但应 避免反复冻融(最多冻融3次)。采集的样品密封后,采用保温壶或保温桶加冰密封,尽快运送到实 验室。 8操作方法 8.1样本核酸的提取 在样本处理区进行。 8.1.1提取方法1 8.1.1.1取n个1.5mL灭菌Eppendorf管,其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之 和,对每个管进行编号标记。 8.1.1.2每管加入1.0mL裂解液,然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照各100μL,一份样本 换用一个吸头,混匀器上震荡混匀5s,于4℃~25℃条件下,10000r/min离心10min。 8.1.1.3取与8.1.1.1中相同数量的1.5mL灭菌Eppendorf管,加入500μL无水乙醇(-20℃预 不要吸出底部沉淀,颠倒混匀。 8.1.1.4于4℃~25℃条件下,5000r/min离心5min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放 置)。轻轻倒去上清,倒置于吸水纸上,吸干液体,不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加入1.0mL 1)由指定单位提供,给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具 有相同的效果,则可使用这些等效产品。 2 GB/T19915.6—2005 75%乙醇,颠倒洗涤。 8.1.1.5于4℃~25℃条件下,5000r/min离心10min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放 置)。轻轻倒去上清液,倒置于吸水纸上,吸干液体,不同样品应在吸水纸不同地方吸干。 8.1.1.64000r/min离心10s,将管壁上的残余液体甩到管底部,用微量加样器尽量将其吸干,一份 样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀一面,室温干燥5s~15s。不宜过于干燥,以免DNA不溶。 8.1.1.7加入11μL无DNA酶的灭菌纯化水,轻轻混匀,溶解管壁上的DNA,2000r/min离心5s, 冰上保存备用。 8.1.2提取方法2 8.1.2.1取n个1.5mL灭菌Eppendorf管,其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之 和,对每个管进行编号标记 份样本换用一个吸头,混匀器上震荡混匀5s,于4℃~25℃条件下,13000r/min离心10min。 8.1.2.3尽可能吸弃上清且不碰沉淀,再加人10μLDNA提取液2,混匀器上震荡混匀5s。于4℃~ 25℃条件下,2000r/min离心10s。 8.1.2.4100℃干浴或沸水浴10min;加入40μL无DNA酶的灭菌纯化水,13000r/min离心10min, 上清即为提取的DNA,冰上保存备用。 8.1.3DNA提取后的处理要求 提取的DNA须在2h内进行PCR扩增或放置于一70℃冰箱。 8.2扩增试剂准备与配制 在反应混合物配制区进行。 从试剂盒中取出猪源链球菌通用荧光PCR反应液、Taq酶,在室温下融化后,2000r/min离心5s。 设所需PCR数为n,其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和。每个测试反应体系需 使用15μLPCR反应液及0.3μLTaq酶。计算各试剂的使用量,加人一适当体积试管中,向每个PCR 管中各分装15μL,转移至样本处理区。 8.3加样 在样本处理区进行。在各设定的PCR管中分别加入8.1.1.7或者8.1.2.4中制备的DNA溶液 10μL,使总体积达25μL。盖紧管盖后,500r/min离心30s。 8.4荧光PCR反应 在检测区进行。将8.3中加样后的PCR管放人荧光PCR检测仪内,记录样本摆放顺序。 反应参数设置: 一第一阶段,预变性92℃3min; 一第二阶段,92℃5s,60℃30s,45个循环,荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进 行。 9结果判定 9.1结果分析条件设定 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点,不同仪器可 根据仪器噪音情况进行调整。 9.2质控标准 9.2.1阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。 9.2.2阳性对照的Ct值应≤30.0,并出现特定的扩增曲线。 9.2.3如阴性对照和阳性条件不满足以上条件,此次实验视为无效。 3

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