ICS 65.020.30 B 40 GR 中华人民共和国国家标准 GB/T 24862—2010 畜禽体细胞库检测技术规程 Technical regulation of farm animals somatic cell bank detection 2010-06-30发布 2011-01-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T24862—2010 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274）归口。 本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：马月辉、关伟军、李向臣、于太永、李晗、何晓红、刘涛 GB/T24862—2010 畜禽体细胞库检测技术规程 1范围 本标准规定了畜禽体细胞库检测方法 本标准适用于猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅等畜禽体外培养细胞鉴定 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 细胞活率 cell motility rate 活细胞占总细胞的百分比。 3.2 细胞生长曲线 cell growthcurve 在一代细胞生存期内，依据潜伏期、指数增长期、停滞期和衰亡期细胞动态变化的数值，以细胞培养 时间为横坐标、细胞密度为纵坐标而绘制的细胞生长规律曲线。 3.3 SAC 核型karyotype 体细胞分裂中期整套染色体按照其数目、长度、着丝点位置、随体、主痕和次痕等相对恒定特征 排列起来的图像。 3. 4 同工酶 每isozyme 功能相同结构各异的一类催化酶。 3.5 汇合度 confluency 细胞占其培养表面的比例。 4工作区条件 工作区一般要由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保存室组成 其中，缓冲间面积应不小于3m，并设有更衣柜和紫外灯，紫外灯的强度不少于1.5W/m。紫外线灯 管距地面不应超过2.5m，每次照射时间为20min~30min。无菌室无菌等级的最低标准应达到万级 5主要仪器、设备 电泳仪及电泳槽、超净工作台、冰箱、鼓风干燥箱、高压蒸汽消毒器、液氮生物容器、离心机、电子天 平、恒温培养箱、CO，培养箱、超纯水装置、凝胶自动成像分析系统和显微镜等。 1 GB/T24862—2010 6清洗与消毒 6.1玻璃器血清洗与消毒 6.1.1浸泡 所需的玻璃器血在含有洗涤剂的清水中浸泡12h。 6.1.2刷洗 选软毛毛刷，反复洗刷后用清水冲洗3次，三蒸水冲洗3次后，60℃下烘干后备用 6.1.3酸浸 酸浸时间为24h。 6.1.4冲洗 酸浸后先用自来水反复冲洗10次以上，最后用重蒸水浸洗3次～5次，烘干包装。 6.1.5消毒 高压灭菌应以0.14MPa～0.16MPa的压力下持续15min~30min。 6.1.6初次玻璃器血使用 初次使用玻璃器血需要先经过浸泡和洗刷再置于5%稀盐酸溶液中浸泡12h以上，其余操作同 6.1.3、6.1.4和6.1.5等步骤。 6.2金属器血清洗与消毒 金属材质的器具除了没有酸浸处理步骤外，其余步骤同6.1。 6.3塑料与橡胶制品清洗与消毒 塑料和橡胶材质的器具用清水浸泡和冲洗同玻璃器皿清洗，之后还需要用2%的NaOH溶液浸泡 12h，清水冲洗和烘干后用1%稀盐酸浸泡30min，再用清水和三蒸水分别冲洗3次，高压灭菌和烘干 后备用。高压灭菌以0.073MPa的压力下持续10min。 7主要试剂与溶液配制 主要试剂与溶液配制参见附录A。除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T6682一级用水的要求 8体外培养细胞鉴定 8.1细胞形态检测 8.1.1光学显微镜检测 在倒置相差显微镜下，直接观察和记录培养细胞的形态和生长状况。刚贴壁细胞边界清晰，核呈圆 形，核浆比率小，细胞排列整齐，无重叠生长。 8.1.2Giemsa染色检测 将盖玻片置于细胞培养瓶中，在5%CO，培养箱中37℃培养，细胞形成单层后，取出盖玻片，用磷 酸缓冲盐溶液（phosphatebufferedsaline，PBS）冲洗，放在载玻片上，自然干燥。固定液固定10min， Giemsa染色2min，置于显微镜下观察。正常细胞的细胞核被染成紫红色或蓝紫色，细胞质被染成浅 红色。 8.2微生物检测 8.2.1细菌和真菌检测 取5μL细胞悬液，置于8mL无抗生素培养基中，混匀，300g离心5min，重复2次。再用2mL无 抗生素培养基重悬，取0.5mL接种到胰蛋白陈培养基中，置于37℃培养箱以检测细菌；取0.5mL接 种到麦芽汁培养基中，置于26℃培养箱以检测真菌。分别培养2周后，晃动悬液，置于显微镜下观察， 无异物则细胞未受细菌和真菌污染 2 GB/T24862—2010 8.2.2支原体检测 将畜禽细胞接种到无抗生素的培养基中进行细胞单层培养，待盖玻片细胞汇合度达到50%～60% 取出。PBS漂洗，固定液浸泡盖玻片，固定10min后再用PBS漂洗。将Hoechst33258染液滴加到已 固定的细胞上，染色30min。用PBS漂洗3次，每次3min～5min。将1滴含1%封片液的PBS滴加 到已染色的细胞上，翻转盖玻片盖于载玻片上。用100倍～400倍荧光显微镜观察。细胞核外无蓝色 荧光小点或丝状荧光物表明细胞未受支原体污染。 8.2.3病毒检测 利用酶联免疫吸附试验、免疫酶试验、免疫荧光试验、血凝试验、血凝抑制试验、免疫酶组织化学、放 射免疫测定等方法对畜禽体细胞库进行病毒检测。 8.3细胞活率检测 细胞汇合度达到80%~85%，常规法消化，制成1.0×10%个/mL~3.0×106个/mL的细胞悬液。 取一滴悬液和一滴0.4%台盼蓝溶液混匀，静置2min。用血球计数板计算细胞总数和未着色细胞数。 8.4细胞生长周期鉴定 细胞汇合度达到80%～85%，常规法消化，制成悬液，计数。分别向培养板21个孔接种1.0×104个～ 2.0×104个细胞，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。每隔24h计数3个孔内的细胞密度，用血球计 数板计算细胞总数，取3孔的平均值，连续计数7d。以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标，绘制细 胞的生长曲线。正常生长曲线包括潜伏期、指数增长期、停滞期和衰亡期四个阶段。 8.5细胞表面抗原检测 细胞接种在盖玻片上。用固定液固定，一20℃放置20min。弃去固定液，用PBS漂洗3次，每次 3min，加入血清，静置20min，用PBS洗去血清。加入相应的一抗，37C孵育30min，室温放置1h~ 3h。用PBS漂洗后，加人相应的二抗，37C孵育20min。用PBS漂洗，封片，镜检。细胞表面特异性抗 原与特异性抗体结合，荧光显微镜下进行观察。 8.6细胞核型检测 8.6.1秋水仙素处理 取对数生长期的细胞，加秋水仙素使其终浓度为0.1μg/mL～0.4μg/mL。在37℃、5%CO2培 养箱中继续培养1h6h，使大部分细胞处于分裂中期。 8.6.2分裂相细胞采集 用常规方法消化收集细胞。转人15mL离心管，以300g离心8min，收集细胞 8.6.3低渗 弃上清液，加人预热至37℃、0.075mol/L（或0.4%）KCl溶液2mL，轻轻吹打，继续加至10mL， 37℃温箱中温育30min~40min。 8.6.4预固定 在温育后的悬液中加人新鲜固定液1mL，混匀，将悬液以300g离心8min，弃上清。 8.6.5固定 加人新鲜固定液5mL，打匀，室温静置20min。300g离心8min，弃上清。 8.6.6重固定 重复8.6.5步骤，离心后留1mL~1.5mL上清液，混匀。 8.6.7滴片 取2滴～3滴细胞悬液，滴在倾斜45°的预冷载玻片上，干燥。 8.6.8染色 用PBS(pH6.8）稀释10倍的Giemsa液染色10min，自来水冲洗，干燥。 8.6.9封片 将载玻片二甲苯固定两次后，用中性树胶封片。 3