ICS 67.050 x 04 GR 中华人民共和国国家标准 GB/T22957—2008 河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中九种糖皮质激素 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of nine glucocorticoids residues in fugu,eel and baked eel- LC-MS-MS method 2008-12-31发布 2009-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22957—2008 前言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局 本标准主要起草人：刘永明、李金、吴艳萍、冯冠、曹彦忠、庞国芳。 GB/T22957—2008 河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中九种糖皮质激素 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中泼尼松龙、泼尼松、氢化可的松、可的松、甲基泼尼松龙、倍他米 松、地塞米松、倍氯米松、醋酸氟氢可的松九种糖皮质激素残留量的液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中九种糖皮质激素残留量的测定 本标准的方法检出限：泼尼松龙、泼尼松、氢化可的松、可的松、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松 为0.2μg/kg；倍氯米松、醋酸氟氢可的松为1.0μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 (GB/T 6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2：1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682一2008ISO3696：1987，MOD） 3原理 河豚鱼、鳗鱼、烤鳗样品中加入无水硫酸钠，用乙酸乙酯提取，提取液浓缩后，经过硅胶固相萃取柱 净化，液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。 4试剂和材料 4.1水:GB/T6682，一级 SAC 4.2甲醇：色谱纯。 4.3乙腈：色谱纯。 4.4Z 乙酸乙酯：色谱纯。 4.5 甲酸：优级纯。 4.6 正已烷：色谱纯。 4.7 丙酮：色谱纯。 4.8 丙酮-正已烷溶液：丙酮+正已烷（2+3）。量取200mL丙酮与300mL正已烷混匀。 4.9无水硫酸钠：分析纯。在650℃马弗炉中灼烧6h，储存于干燥器中。 4.10泼尼松龙（CAS：50-24-8）、泼尼松（CAS：53-03-2）、氢化可的松（CAS：50-23-7）、可的松（CAS：53- （CAS：4419-39-0）、醋酸氟氢可的松（CAS：514-36-3）标准物质：纯度≥98%。 4.111.0mg/mL标准储备溶液：分别准确称取适量的糖皮质激素标准物质，用甲醇溶解，分别配制成 1 GB/T22957—2008 1.0mg/mL储备溶液。配成的标准储备液应在温度低于一20℃冰箱中保存。 4.125.0μg/mL标准工作溶液：分别准确吸取适量的糖皮质激素标准储备溶液，用甲醇分别配制成 5.0μg/mL标准工作溶液。配成的标准工作溶液应在温度低于4℃冰箱中保存 0.05μg/mL的混合标准工作溶液。此溶液应在温度低于4℃冰箱中保存。测定样品使用时，用20% 乙睛溶液将混合标准工作溶液I配成不同浓度的的混合标准工作溶液。 4.14混合标准工作溶液Ⅱ：分别吸取适量的泼尼松龙、泼尼松、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、倍 松为0.05μg/mL，倍氯米松、醋酸氟氢可的松为0.25μg/mL的混合标准工作溶液。此溶液应在温度 低于4℃冰箱中保存。 4.15基质混合标准工作溶液：用空白样品提取液将混合标准工作溶液Ⅱ配成不同浓度的基质混合标 准工作溶液。此溶液应现用现配。 4.16CleanertSilica固相萃取柱"或相当者：500mg，6mL。使用前用6mL正已烷预处理，保持柱体 湿润。 4.17滤膜：0.2μm 5仪器 5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。 5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g。 5.3 固相萃取真空装置。 5.4真空泵：真空度应达到80kPa。 5.5均质器。 5.6振荡器。 5.77 高速冷冻离心机：转速13000r/min。 5.8 旋转蒸发器。 5.9氮气浓缩仪。 5.10具塞塑料离心管：50mL。 5.11样品管：10mL。 5.12梨形瓶：150mL。 SAG 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 从全部样品中取出有代表性样品约1kg，充分搅碎，混匀，均分成两份，分别装洁净容器内。密 封作为试样，注明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 6.2试样保存 将试样于一18℃冷冻保存。 7测定步骤 7.1提取 称取5g试样（精确到0.01g），置于50mL具塞塑料离心管中，加入10g无水硫酸钠，加25mL乙 CleanertSilica固相萃取柱是Agela公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是 1） 表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2 GB/T22957—2008 酸乙酯，用均质器均质1min，在振荡器中振荡20min，以10000r/min离心10min，取上清液至梨形瓶 中。再用25mL乙酸乙酯提取一次，合并上清液，用旋转蒸发器于45C水浴上减压蒸发至近干，用 1mL乙酸乙酯和5mL正己烷溶解。 7.2净化 将提取液移至经预处理的CleanertSilica固相萃取柱中，用6mL正已烷洗涤梨形瓶和萃取柱，弃 去全部流出液。减压抽干1min，用6mL丙酮十正已烷（2十3）洗脱，收集洗脱液于10mL样品管中，用 氮气浓缩仪吹干，用1mL20%乙腈溶液溶解残渣，以4000r/min离心5min，上清液过0.2um滤膜， 供液相色谱-串联质谱仪测定。 7.3测定条件 7.3. 1 液相色谱参考条件 a) 色谱柱：AtlantisCi8，3μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者； b) 柱温：30℃； c) 进样量：20μL； d) 流动相、流速和梯度洗脱条件见表1 表1流动相、流速和梯度洗脱条件 时间/min 流速/（μL/min） 乙腈/% 0.1%甲酸溶液/% 0.00 200 20 80 10.00 200 70 30 13.00 200 90 10 13.01 200 20 80 20.00 200 20 80 7. 3. 2 质谱参考条件 离子源：电喷雾离子源（ESI)； a) b) 扫描方式：负离子扫描； 检测方式：多反应监测； c) d) 气帘气压力：0.138MPa； 雾化气压力：0.276MPa； f) 辅助加热气压力：0.138MPa； g) 离子源温度：500℃； h) 定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞能量见表2。 表2糖皮质激素的定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞能量 化合物中文名称 化合物英文名称 定性离子对（m/2）定量离子对（m/2） 去簇电压/V 碰撞能量/V 405/329 -30 25 泼尼松龙 prednisolone 405/329 405/359 30 -15 -19 403/327 21 泼尼松 prednisone 403/327 403/357 -19 -15 407/331 28 25 氢化可的松 hydrocortisone 407/331 407/361 -28 -15 405/329 22 24 可的松 cortisone 405/329 405/359 -22 -15 3