ICS 67. 100 53 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 22400—2008 原料乳中三聚氰胺快速检测 液相色谱法 Rapid determination of melamine in raw milk- High performance liquid chromatography method 2008-10-15发布 2008-10-15实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22400—2008 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由中国计量科学研究院提出 本标准由全国仪器分析测试标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：中国计量科学研究院。 本标准参加起草单位：中华人民共和国陕西出人境检验检疫局、中国人民解放军总医院、北京市产 品质量监督检验所、国家地质实验测试中心、北京理工大学、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、 北京大学、北京市营养源研究所、军事医学科学院、北京科技大学、清华大学。 本标准主要起草人：李红梅、张庆合、汤桦、何雅娟、全灿、李秀琴、黄挺、苏福海、戴新华、马康、 李晓敏、宋德伟、徐蓓、 GB/T22400—2008 原料乳中三聚氰胺快速检测 液相色谱法 1范围 本标准规定了液相色谱法快速检测原料乳中三聚氰胺的方法。 本标准适用于原料乳，也适用于不含添加物的液态乳制品。 本标准定量检测范围为0.30mg/kg~100.0mg/kg，方法检测限为0.05mg/kg。 注：当原料乳中三聚氰胺的含量大于100.0mg/kg时，具体操作方法见6.2.2.3.2 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2:1994,IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987,MOD） 3原理 用乙睛作为原料乳中的蛋白质沉淀剂和三聚氰胺提取剂，强阳离子交换色谱柱分离，高效液相色 谱-紫外检测器或二极管阵列检测器检测，外标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1乙睛（CH,CN)：色谱纯 4.2磷酸(H.PO)。 4.3磷酸二氢钾（KH,PO）。 4.4三聚氰胺标准物质（C,H,N）：纯度大于或等于99%。 4.5三聚氰胺标准贮备溶液（1.00×10*mg/L）：称取100mg（准确至0.1mg）三聚氰胺标准物质，用 水完全溶解后，100mL容量瓶中定容至刻度，混匀，4℃条件下避光保存，有效期为1个月。 4.6标准工作溶液：使用时配制。 4.6.1标准溶液A（2.00X10²mg/L）：准确移取20.0mL三聚氰胺标准贮备溶液（4.5），置于100mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。 4.6.2标准溶液B(0.50mg/L)：准确移取0.25mL标准溶液A（4.6.1)，置于100mL容量瓶中，用水 稀释至刻度，混匀。 4.6.3按表1分别移取不同体积的标准溶液A（4.6.1）于容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。按表2分 别移取不同体积的标准溶液B（4.6.2）于容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。 1 GB/T22400—2008 表 1 标准工作溶液配制（高浓度） 标准溶液A体积/mL 0.10 0.25 1.00 1. 25 5.00 12.5 定容体积/mL 100 100 100 50.0 50.0 50.0 标准工作溶液浓度/（mg/L） 0. 20 0.50 2.00 5.00 20. 0 50.0 表2 标准工作溶液配制（低浓度） 标准溶液B体积/mL 1. 00 2. 00 4.00 20.0 40.0 定容体积/mL 100 100 100 100 100 标准工作溶液浓度/（mg/L） 0.005 0.01 0.02 0.10 0.20 4.7磷酸盐缓冲液（0.05mol/L)：称取6.8g（准确至0.01g）磷酸二氢钾（4.3）,加水800mL完全溶 解后，用磷酸（4.2调节pH至3.0，用水稀释至1L，用滤膜（4.9）过滤后备用。 4.8 一次性注射器：2mL。 4.9滤膜：水相，0.45μm。 4.10针式过滤器：有机相，0.45um。 4.11具塞刻度试管：50mL。 5仪器 5.1液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。 5.2分析天平：感量0.0001g和0.01g。 5.3pH计：测量精度±0.02。 5.4溶剂过滤器。 6测定步骤 SAC 6.1试样的制备 称取混合均匀的15g（准确至0.01g）原料乳样品，置于50mL具塞刻度试管（4.11）中，加人 30mL乙睛（4.1）剧烈振荡6min，加水定容至满刻度，充分混匀后静置3min，用一次性注射器（4.8） 吸取上清液用针式过滤器（4.10)过滤后，作为高效液相色谱分析用试样 6.2高效液相色谱测定 6.2.1色谱条件 6.2.1.1色谱柱：强阳离子交换色谱柱，SCX，250mmX4.6mm（内径），5μm，或性能相当者。 注：宜在色谱柱前加保护柱（或预柱），以延长色谱柱使用寿命。 6.2.1.2流动相：磷酸盐缓冲溶液（4.7)-乙睛（70+30，体积比），混匀。 6.2.1.3流速：1.5mL/min。 6.2.1.4柱温：室温。 6.2.1.5检测波长：240nm 6.2.1.6进样量：20μL。 6.2.2液相色谱分析测定 6.2.2.1仪器的准备 开机，用流动相平衡色谱柱，待基线稳定后开始进样。 6.2.2.2定性分析 依据保留时间一致性进行定性识别的方法。根据三聚氰胺标准物质的保留时间，确定样品中三聚 氰鼠胺的色谱峰（参见附录A）。必要时应采用其他方法进一步定性确证。 2 GB/T22400—2008 6.2.2.3定量分析 校准方法为外标法。 6.2.2.3.1校准曲线制作 根据检测需要，使用标准工作溶液（4.6.3）分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为 纵坐标，绘制校准曲线。 6.2.2.3.2试样测定 使用试样（6.1）分别进样，获得目标峰面积。根据校准曲线计算被测试样中三聚氰胺的含量 (mg/kg)。 试样中待测三聚氰胺的响应值均应在方法线性范围内。 注：当试样中三聚氰胺的响应值超出方法的线性范围的上限时，可减少称样量再进行提取与测定。 6.2.3结果计算 6.2.3.1计算公式 结果按式(1)计算： V1 000 X=cX (1) X1000 式中： X一原料乳中三聚氰胺的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； c—从校准曲线得到的三聚氰胺溶液的浓度，单位为毫克每升（mg/L）； V——试样定容体积，单位为毫升（mL)； m——样品称量质量，单位为克（g）。 6.2.3.2计算结果有效数字 通常情况下计算结果保留三位有效数字；结果在0.1mg/kg~1.0mg/kg时，保留两位有效数字； 结果小于0.1mg/kg时，保留一位有效数字。 6.3平行试验 按以上步骤，对同一样品进行平行试验测定。 6.4空白试验 除不称取样品外，均按上述步骤同时完成空白试验。 6.5方法检测限 本方法的检测限为0.05mg/kg。 6.6回收率 SZIG 在添加浓度0.30mg/kg~100.0mg/kg范围内，回收率在93.0%~103%之间，相对标准偏差小于 10%。 7精密度 本标准精密度数据按照GB/T6379.1和GB/T6379.2规定确定，其重复性和再现性值以95%的 置信度计算。 7.1重复性 在重复性条件下，获得的两次独立测量结果的绝对差值不超过重复性限，样品中三聚氰胺含量范 围及重复性方程见表3。 如果两次测定值的差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。 7.2再现性 在再现性的条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，样品中三聚氰胺的含 量范围及再现性方程见表3。 3